复方丹参注射液对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

兰鸿 陈鸿梅

湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北十堰 442000

复方丹参注射液对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

兰鸿 陈鸿梅▲

湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北十堰 442000

目的观察复方丹参注射液对急性脊髓损伤大鼠的保护作用。方法采用改良Allen weight dropping（Allen WD）打击法将42只Wistar大鼠制成脊髓中度损伤模型，分别给予复方丹参注射液、甲基强的松龙及生理盐水治疗，观察动物不同时间的神经功能评分、斜板试验及脊髓细胞凋亡率的变化。结果从伤后2周起，丹参组的神经功能评分和斜板最大角度分别与生理盐水组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。从伤后12 h起，丹参组细胞凋亡率与生理盐水组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丹参组与甲强龙组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论复方丹参注射液对大鼠脊髓损伤细胞凋亡具有保护作用，能够达到治疗急性脊髓损伤的作用。

丹参；急性脊髓损伤；大鼠；细胞凋亡

随着交通业和建筑业的发展，临床中急性脊髓损伤（acute spinal cord injury）逐渐增加。急性脊髓损伤具有较高的致残率，研究表明急性脊髓损伤后二次脊髓打击程度远远大于原发损伤[1]。临床中如何避免继发性脊髓二次打击成为治疗急性脊髓损伤的关键。虽然文献中多有报道急性脊髓损伤后即刻大剂量甲强龙治疗方法，但研究发现甲强龙虽能改善急性脊髓损伤发展结果，但有增加相关并发症的可能。近年来有学者尝试使用丹参治疗急性脊髓损伤的报道。本文通过实验初步探讨丹参对急性脊髓损伤的神经保护作用。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠，42只，体重0.20～0.25 kg，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（鄂）2005-0031。

丹参注射液（上海中西医制药有限公司）；甲基强的松龙琥珀酸钠（美国Upjohn公司）；细胞凋亡检检测试剂盒（POD武汉博士德生物工程有限公司）；异氟烷和脂肪乳（黑龙江省集成医药实业有限公司）。

1.2 急性脊髓损伤模型制备

将42只Wistar大鼠随机分为三组，每组14例：生理盐水组、丹参组、甲强龙组。将把异氟烷和脂肪乳混合做成乳化异氟烷。制备方法：用30%脂肪乳为载体，室温下（20℃）应用玻璃瓶法，配制8%乳化异氟烷，即将1.2 mL的液态异氟烷和21.3mL的30%脂肪乳加入至一个气密性良好的25～30mL玻璃容器内，振荡器上以2 000 r/min的速度剧烈震荡30 s，静置30 s，然后以2 000 r/min速度剧烈震荡50 min，达到平衡后置于4℃冰箱中备用。后以0.51～0.64mL/kg腹腔注射，麻醉后采用改良Allen WD打击法制备ASCI模型。剔除大鼠背部正中毛发，选择后正中切口显露T8-T10椎板，切除椎板过程中注意保护硬脊膜完整性。将预备的铜片制成曲度直径与椎管相似圆形垫片，将垫片放置于硬脊膜表面。将两头相通的玻璃试管垂直放置与显露创面上方，选择重7.5 g铜锤从高10 cm处通过玻璃试管自由下落，打击垫片，造成急性脊髓损伤模型，关闭手术切口。术后采用人工挤压膀胱方法辅助排尿，每日6次。

1.3 给药方法

大鼠造成急性脊髓损伤后，复方丹参注射液1.08mg/kg体重，给予腹腔注射，每日1次，共连续注射7 d；甲强龙15min内按照30mg/kg给予腹腔注射，伤后1 h开始，以5.4mg/（kg·h）腹腔注射，共23 h，平均分4次使用。生理盐水组伤后按照丹参组方法腹腔注射生理盐水。

1.4 细胞凋亡检测

随机取4只大鼠，于造模后24 h、2、4、6周，开胸经心脏先以生理盐水灌注，观察液体变清后，以5%多聚甲醛磷酸液行脊髓灌注，脊髓固定后，通过原切口显露脊髓并切取损伤阶段约5mm，再次以5%多聚甲醛磷酸液浸泡24 h，采用脱水石蜡常规包埋，连续切取厚度5μm切片10张，随机选取4张切片放入细胞凋亡检测试剂盒检测，凋亡细胞核显微镜下观察呈黄色。经计算机分析处理系分别检测出每张切片凋亡细胞数和总细胞数，以凋亡细胞数/总细胞数计算凋亡指数。

1.5 观察指标

分别于术后2、4、6周测量大鼠斜板试验度数和大鼠运动功能评分（BBB评分）。斜板试验[2]：将斜板与大鼠长轴呈垂直放置，缓慢抬高斜板，每次抬高5°，观察大鼠能够在斜板上停留5 s的最大度数，反复测量3次，取平均值，计算大鼠斜板试验功能值。BBB评分以Basso等[3]描述的方法为准，采用盲法原则，有其他人员观察测量。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡检测结果

结果显示，丹参组和甲强龙组细胞凋亡指数均低于生理盐水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参组与甲强龙组细胞凋亡指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 细胞凋亡检测结果（±s）

表1 细胞凋亡检测结果（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05

组别只数凋亡指数24 h 2周4周6周生理盐水组丹参组甲强龙组444 47.38±4.07 31.45±3.09* 30.94±3.56* 39.41±3.35 24.59±3.18* 25.28±3.41* 31.84±3.62 14.76±3.27* 13.34±3.54* 27.59±3.37 7.46±3.36* 8.23±3.40*

2.2 斜板试验结果

结果显示，丹参组和甲强龙组大鼠斜板试验功能值均高于生理盐水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 斜板试验比较（±s，°）

表2 斜板试验比较（±s，°）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05

组别只数最大斜板试验度数2周4周6周生理盐水组丹参组甲强龙组10 10 10 19.48±6.56 28.56±5.79* 29.28±5.43* 28.57±5.82 44.68±5.19* 46.78±5.15* 35.75±6.23 54.26±5.42* 55.91±5.84*

2.3 BBB评分结果

结果显示，丹参组和甲强龙组大鼠运动功能评分（BBB评分）均高于生理盐水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

研究表明急性脊髓损伤后脊髓受到双重打击，首先如外伤导致直接的脊髓压迫，致使压迫部位出血、坏死；其次压迫后若不能及时解除压迫脊髓出现、缺血水肿，局部吞噬细胞、组织因子等炎症介质渗出，缺血等因素激活谷氨酸受体，致具有细胞毒性物质溢出，使脊髓遭受二次打击，引起细胞凋亡。二次脊髓打击是持续过程，且其过程是可逆的，若临床中能够及时阻断脊髓二次打击，可有效阻止神经细胞凋亡和功能退变，保护神经细胞，促进神经细胞和轴突生长，有助于脊髓功能恢复。

表3 BBB评分比较（±s，分）

表3 BBB评分比较（±s，分）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05

组别只数BBB评分2周4周6周生理盐水组丹参组甲强龙组10 10 10 5.84±0.63 7.16±0.97* 7.78±0.85* 8.07±1.41 12.86±1.24* 13.46±1.57* 9.15±1.67 13.76±1.35* 14.19±1.48*

丹参有效成分为丹参酮，研究表明丹参酮可抑制炎症一期反应中组织胺对毛细血管的作用，降低毛细血管通透性，同时可以抑制二期炎症反应中白细胞通过毛细血管向组织游走，达到抑制炎症反应。最近研究表明核因子-κB（NF-κB）通过逆转录参与多核细胞的炎症反应，在炎症反应中起到重要作用[4]，汪吉明等[5]研究表明急性创伤性脊髓损伤后，复方丹参可以抑制NF-κB的活性表达，对减轻NF-κB介导的炎症反应，降低炎症介质对脊髓神经细胞的毒性作用。急性脊髓损伤后数小时内可激发血液系统的凝血功能，血液处于高凝状态[6]，丹参酮可扩张微循环，增加受损部位神经细胞血供，减缓或抑制细胞凋亡。余永桂等[7]将急性脊髓损伤模型分为丹参治疗组和生理盐水治疗组，结果显示丹参组细胞凋亡数低于生理盐水治疗组，丹参组bcl-2表达增高，他们认为丹参可能通过“抑制氧自由基脂质过氧化、减少细胞钙内流、调节细胞因子和上调bcl-2”的作用达到抑制细胞凋亡的作用。本研究中细胞凋亡检测表明丹参组术后24 h、2、4、6周细胞凋亡指数分别为（31.45±3.09）、（24.59±3.18）、（14.76±3.27）和（7.46±3.36），低于生理盐水治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），且丹参组细胞凋亡指数降低速度大于生理盐水治疗组，说明丹参对急性脊髓损伤具有治疗作用。试验结果显示丹参组大鼠BBB评分和斜板试验均高于生理盐水治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），笔者认为丹参通过抑制急性脊髓损伤后炎症反应和扩张局部微循环达到抑制细胞凋亡，治疗急性脊髓损伤的作用。临床观察表明经丹参治疗患者全血黏度切变值、纤维蛋白原、红细胞聚集指数及红细胞变形指数均有明显改善，说明丹参可改善急性脊髓损伤患者末循环，起到保护ASCI的作用。

目前临床中多使用大剂量甲基强的松龙琥珀酸钠冲击治疗急性脊髓损伤，研究显示甲强龙可减轻急性脊髓损伤后脊髓水肿、炎症反应等继发脊髓损伤，达到治疗作用。本研究中发现丹参治疗组大鼠细胞凋亡指数、BBB评分和斜板试验与甲强龙组相似，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明丹参对脊髓继发损伤的治疗作用与甲强龙相似。文献报道大剂量甲强龙冲击治疗可引起较多并发症，限制了甲强龙的应用。故笔者认为丹参可替代甲强龙用于治疗急性脊髓损伤。

本实验为丹参应用治疗急性脊髓损伤提供了理论依据，但本研究未涉及分子机制，以后研究中有待于对丹参治疗急性脊髓损伤的分子机制做进一步探讨。

[1]Beulter B.Toll-like receptor：how they work and what they do[J].Curr Opin Hematol，2002，（9）：2.

[2]杨挺，蒋赞利，茅祖斌.血塞通联合复方丹参注射液对大鼠急性脊髓损伤的治疗作用及其机制的初步研究[J].现代医药，2010，38（2）：129-132.

[3]Basso DM，Beattiem S，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale foropen-field testing in rats[J].J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

[4]丛斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导大鼠肺组织NF-κB活性增高的抑制作用[J].中国病理生理杂志，2000，16（10）：991.

[5]汪吉明，孔抗美，齐伟力，等.复方丹参对大鼠急性脊髓损伤后核因子-κB活性的影响[J].中国骨与关节损伤，2007，22（4）：307-309.

[6]许健强，张庆俊.脊髓损伤后的高凝状态[J].中国脊柱脊髓杂志，2002，12（6）：422-423

[7]余永桂，张功礼，施永彦，等.丹参注射液椎管内局部灌注对急性脊髓损伤的保护作用[J].中华试验外科杂志，2004，21（8）：993-994.

Protective affect of Com pound Danshen Injection for rats w ith acute spinal cord injury

LAN Hong CHEN Hongmei▲
Departmentof Pharmacy,Taihe Hospital Affiliated to HubeiUniversity ofMedicine,HubeiProvince,Shiyan 442000,China

ObjectiveTo observe the protective affect of Compound Danshen Injection for rats with acute spinal cord injury.MethodsThe ratswere established themodel ofmoderate spinal cord injury by amodification of Allen weight dropping(Allen WD)method and treated with Compound Danshen Injection,Methylprednisolone and physiological saline,respectively,as treatment.Neurological functions were evaluated by using Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores,and the angle of clivus test and cell apoptosiswere performed at 12 h after injury.ResultsThere were significant differences(all P＜0.05)in BBB scores and angle of clivus test between Danshen group and control group from the second week.There were significant differences(P＜0.05)in cell apoptosis between Danshen group and control group from the lst hour.There was no significant differences between Danshen group and Methylprednisolone grorp(P＞0.05).ConclusionCompound Danshen Injection has a protective effect on cell apoplosis of ratswith acute spinal cord injury.

Danshen;Acute spinal cord injury;Rats;Cell apoptosis

R683.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0111-03

▲通讯作者

2012-06-12 本文编辑：卫轲）