黄芪多糖抗S180肉瘤作用及其免疫调节的影响

2012-11-13邹品文赵春景尹小燕

遵义医科大学学报 2012年1期

邹品文，赵春景，李攀，尹小燕，黄红

(1. 重庆医科大学附属第二医院药剂科，四川重庆 400010；2. 重庆医科大学附属第二医院超声研究所，四川重庆 400010；3. 四川省都江堰市疾控中心，四川都江堰 611830；4.四川大学附属第二医院，四川成都 610041)

邹品文1，赵春景1，李攀2，尹小燕3，黄红4

黄芪是一味应用广泛的传统补益类中药，最初记载于《神农本草经》，位列上品，为补药之长。其性微温，味甘，归肺、脾二经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)，是黄芪的主要活性成分之一，具有免疫促进剂或调节剂的作用，同时具有一定的抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。临床上已经用黄芪多糖治疗肝炎、糖尿病、肿瘤等疾病[1-3]。本实验用S180肉瘤小鼠模型作为研究对象，观察了黄芪多糖的体内外抗S180肉瘤作用及其免疫调节机制，为黄芪多糖在临床应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

1.1.1 仪器生化培养箱(上海搏迅实业有限公司医疗设备厂)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；真空抽滤泵(重庆卫实医疗有限责任公司)；KDC-28高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

1.1.2 材料药品，环磷酰胺注射液(CTX)，江苏恒瑞制药有限公司生产，批号：20110627；药材，黄芪，由重庆医科大学附属第二医院中药房提供；动物，健康昆明种(KM)小鼠，体重16～24 g，6～8周龄，雌雄兼用，重庆腾鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(渝)2007-0006；瘤株，S180瘤株由重庆医科大学海扶肿瘤中心提供；

1.2 方法

1.2.1 黄芪多糖制备[4，5]精密称取黄芪饮片1 000 g，加入一倍体积蒸馏水，浸泡20 h后，再加4倍体积的蒸馏水，加热至100 ℃，40 min，滤过，将滤渣加5倍体积蒸馏水再加热至100 ℃，40 min，过滤，合并滤液后减压蒸馏，浓缩至100 mL左右。精制及检测参照文献[6]。得到淡黄色黄芪多糖8.6526g，纯度96.7%。

1.2.2 黄芪多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用取接种7 d，且肿瘤生长良好、无溃破的腹水型S180荷瘤小鼠，通过颈椎脱臼处死，然后固定在蜡板上，将腹部皮肤用2%碘酊、75%酒精消毒后，抽取腹水(乳白色的浓稠液体，置无菌容器内塞冰袋保存，取一滴置于载玻片上，推片，经瑞氏染色，显微镜下进行细胞分类计数，瘤细胞数为97.6%)。以生理盐水稀释成每毫升含1×107个瘤细胞的混悬液，接种在实验小鼠右前肢腋窝皮下，每只接种0.2 ml上述混悬液。再将接种S180肉瘤的小鼠随机分为实验组、阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组，标记号并称重。小鼠接种S180肉瘤细胞24 h后，实验组每只小鼠隔天按含黄芪多糖50 mg·kg-1、100 mg·kg-1及200 mg·kg-1剂量(剂量参考文献[7])灌胃给药；阴性对照组灌胃与实验组容积相等的生理盐水；阳性对照组给予环磷酰胺注射液，每只小鼠隔天按30 μg·kg-1剂量腹腔注射1次。各组小鼠于给药后的第12天，颈椎脱臼处死，完整剥离出瘤体，称重，计算出抑瘤率。计算方法如下：抑瘤率=(阴性对照组瘤重-用药组瘤重)/阴性对照组瘤重×100%。

1.2.3 黄芪多糖体外抗S180肉瘤作用取接种7 d，且生长良好、无溃破的腹水型S180肉瘤小鼠，颈椎脱臼处死，然后固定于蜡板上，腹部皮肤用2%碘酊、75%酒精消毒后，抽取腹水。以生理盐水稀释成每毫升含1×106个瘤细胞的混悬液，每孔190 μl量接入96孔培养板，置37℃、相对湿度100%、5% CO2、95%空气的培养箱里预培养24 h。然后取黄芪多糖，分别配制50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1的溶液，同时设置环磷酰胺阳性对照组，环磷酰胺浓度为30 μg·mL-1。每孔分别加入药液10 μl；阴性对照组加10 μl含5%新生胎牛血清RPMI 1640培养液。将各组置37℃、相对湿度100%、5% CO2、95%空气的培养箱中培养48 h，然后每孔加MTT 10 μl，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔中加入150 μl二甲基亚砜，轻轻振荡，使甲臜完全溶解，转移至酶标板上，在570 nm波长处测定吸光度(OD值)。

2 结果

2.1 黄芪多糖对小鼠S180肉瘤的影响见表1，黄芪多糖剂量为50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和200 mg·kg-1时，对小鼠S180肉瘤抑瘤率分别为49.26%、61.76%和66.91%，与阴性对照组比较有显著的抑瘤效果(P<0.01)，且在50 mg·kg-1～200 mg·kg-1范围内抑瘤效果与剂量呈正相关。

组别剂量(mg·kg-1)瘤重(g)(x±s)抑瘤率(%)阴性对照/1.36±0.43黄芪多糖500.69±0.43*49.261000.52±0.39*61.762000.45±0.34*66.91环磷酰胺300.39±0.28*71.32

注：与阴性对照组比较，*P<0.01。

2.2 黄芪多糖对小鼠S180肉瘤体外增殖的影响见表2，黄芪多糖浓度为50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1时，对S180肉瘤体外增殖有一定抑瘤作用，与阴性对照组比较有明显的效果(P<0.01)，在50 μg·mL-1～200 μg·mL-1范围内抑瘤效果与浓度呈正相关。

组别剂量(μg·mL-1)OD570(x±s)阴性对照/1.75±0.62黄芪多糖501.58±0.33*1001.33±0.25**2001.17±0.29**环磷酰胺300.69±0.18**

注：与阴性对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

组别剂量(mg·kg-1)CD+4CD+8CD+4/CD+8正常对照/40.37±6.5518.06±0.432.24±0.89荷瘤对照/38.92±5.7429.91±3.871.30±0.73**黄芪多糖5037.25±4.5924.06±3.101.55±0.61*10038.03±4.3321.19±1.651.79±0.51*20039.28±5.1219.27±1.732.04±0.75*环磷酰胺3039.81±2.9618.87±1.332.11±0.49*

注：用药组与荷瘤对照组比较*P<0.05；荷瘤对照组与正常对照组比较**P<0.05。

2.4 黄芪多糖对S180小鼠外周血IL-2和IL-4水平的影响见表4，荷瘤小鼠IL-2水平明显下降，IL-4水平明显升高(P<0.05)；黄芪多糖给药11 d后，各用药组的IL-2水平显著升高，IL-4水平显著降低，用药组与荷瘤对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

组别剂量(mg·kg-1)IL-2IL-4正常对照/146.31±25.1797.98±8.36荷瘤对照/98.65±19.09**126.33±12.11**黄芪多糖50108.77±14.62*118.19±16.26*100121.68±16.37*105.24±15.59*200139.42±20.53*99.49±12.75*环磷酰胺30130.37±18.80*103.18±13.62*

注：用药组与荷瘤对照组比较*P<0.05；荷瘤对照组与正常对照组比较**P<0.05。

3 讨论

黄芪多糖的收率与纯度与提取次数及醇的浓度有关。提取的次数越多，多糖的含量略有提高，但得率有所下降。醇提取液浓度越高，多糖的得率就越高，但含量会下降[4,5,8]。综合成本与收率，在提取与精制过程中，应注意选择合适的提取次数与醇浓度。本实验采用5倍体积水重复提取一次，浓缩后，90% 乙醇提纯精制。

白细胞介素IL-2和白细胞介素IL-4作用于免疫反应的不同阶段，可以协同增强抗肿瘤作用。经典抗肿瘤药环磷酰胺对IL-2的影响相对较弱，对IL-4有一定的影响。表4结果表明，黄芪多糖能显著改善荷瘤小鼠血清中白细胞介素IL-2和白细胞介素IL-4的水平。提示本研究可能是通过提高荷瘤小鼠自身的免疫能力达到抑制肿瘤生长的目的。

传统的化疗药物在杀伤癌细胞的同时，也对人体的正常组织产生毒性，造成许多严重的不良反应，使病人难以耐受，造成治疗失败。黄芪多糖能使肿瘤细胞发生死亡或凋亡同时发挥整体调节作用，改善肿瘤患者包括免疫功能在内的机体机能状况，从而提高恶性肿瘤患者的生存质量和延长肿瘤患者的生存期[9]。因此，黄芪多糖在抗肿瘤及调节免疫方面具有独特的优势。

[1] 吕淑华.黄芪多糖抗肿瘤作用研究进展[J].江西中医学院学报，2009,21(1)：85-87.

[2]张荣泉，王莲，庞文悦. 黄芪多糖的生物活性研究[J].天津药学，2010,22(6)：58-63.

[3]Zhang YW，Wu CY，Cheng JT．Merit of Astragalus polysaccharide in the improvement of early diabetic nephropathy with an effect on mRNA expressions of NF-kappaB and IkappaB in renal cortex of streptozotoxin-induced diabetic rats[J]．J Ethnopharmacol，2007，114(3)：387-392.

[4]李万玉，李安荣，徐晓玉，等. 黄芪多糖的提取方法[J].中国药业，2009,18(11)：87-88.

[5]田喜莲，牟学文.黄芪多糖含量提取及测定方法研究进展[J]. 中国民族民间医药，2010,13(3)：13-15.

[6]宋建华，刘玉玲.黄芪多糖的萃取提纯及组分鉴定[J].实用医药杂志，2011,28(4)：338-339.

[7]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出社，2002.1761-1762.

[8]张先海，史丽岩，史景明.不同方法提取黄芪中黄芪多糖的比较[J].海峡药学，2010,22(10)：79-80.

[9]肖顺汉，任美萍，刘明华，等. 黄芪多糖对荷瘤小鼠IL-2、IL-6、IL-12和TNF-水平的影响[J].四川生理科学杂志，2009，31(1)：7-8.

EffectsofAstragaluspolysaccharidesonAnti-S180sarcomaandimmunologicalregulation

Zoupinwen1，Zhaochunjing1，Lipan2，Yinxiaoyan3，Huanghong4

(1.Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010,China；2. Institute of Ultrasound Imaging, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010,China；3. The Disease control center of Dujiangyan, Dujiang Sichuan yan 611830,China；4.The Second Affiliated Hospital of Sichuan University, Chengdu Sichuan 610041, China)