高效液相色谱法测定18F－FDG 注射液中氨基聚醚含量

赵 岩，王晓静，叶肇云，赵秀岩，姜 华

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

氟［18F］脱氧葡萄糖（18F－FDG）注射液是目前应用最广泛的正电子发射断层扫描（PET）显像剂，主要用于恶性肿瘤的诊断和心肌及大脑葡萄糖代谢的测定。氨基聚醚（K2.2.2）是制备18FFDG 的重要试剂，由于具有较强的毒性，其含量是18FDG注射液质量控制中的一项重要指标。国内外有关K2.2.2含量测定方法较多，主要有薄层色谱法［1］、液相色谱法［2］、液质联用色谱法［3－4］、气相色谱法［5］和紫外分光光度法［6］，其中，薄层色谱法为半定量法，不能准确测定K2.2.2，液相色谱法、气相色谱法和紫外分光光度法的检测限均大于0.25mg／L，液质联用色谱法灵敏度最高，可以精确检测到20μg／L，但因仪器昂贵不易推广。目前，我国18FDG 注射液的生产中依照的标准为国家药品监督管理局颁布的18F－FDG 注射液试行国标，检测限为K2.2.2低于25mg／L，检测方法是由赵贵植等［6］建立的紫外分光光度法，利用K2.2.2在pH 6.4柠檬酸－氢氧化钠缓冲溶液中与铅（Ⅱ）形成的络合物，在紫外波长253nm 处进行定量测定。该方法中本底溶液对结果有干扰，使测定值比实际值偏高，样品用量较大，需使用0.5mL样品完成一次测定。因此，亟需建立准确度更高和样品用量更少的检测方法。

高效液相色谱法具有灵敏度高、样品用量少，可分离混合物的优点。因此，本工作拟在文献［2］的基础上，采用高效液相色谱法对18FFDG 注射液中K2.2.2含量进行测定，优化实验条件，建立适用于本实验室的高效液相色谱测定方法。

1 主要试剂与仪器

1.1 主要试剂

K2.2.2对照品：纯度＞99.0%，ABX 公司；脱氧葡萄糖（2－Deoxy－D－glucose），纯度＞99.5%：Sigma公司。甲醇、乙腈：国产色谱纯；磷酸三铵、乙酸铵：国产分析纯

1.2 主要仪器

高效液相色谱（HPLC）仪：XTerraRP18 色谱柱（150mm×3.9mm，5μm），美国Waters公司；UV－2450紫外可见分光光度计：岛津公司；AB135－S电子天平：瑞士Mettler公司。

2 实验方法

2.1 HPLC流动相的确定

分别采用50%乙腈、85%乙腈、V（50 mmol／L磷酸铵（pH9.3）∶V（乙腈）＝21∶4、V（50 mmol／L 磷酸铵（pH 8.3））∶V（乙腈）＝21∶4和V（50 mmol／L 乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1等5 种不同组分的流动相对100 mg／L K2.2.2和0.5g／L 脱氧葡萄糖进样分析。确定最佳流动相。

2.2 HPLC流速的影响

采用V（50 mmol／L乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1为流动相，流速分别为0.5、1.0mL／min，测定18FDG注射液中K2.2.2的含量，确定最佳流速。

2.3 HPLC测定波长的选择

采用V（50 mmol／L 乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1为流动相，流速0.5 mL／min，向高效液相色谱柱中加入10μL 100mg／L的K2.2.2溶液，分别于210、215、220nm 波长处进行检测，确定最佳检测波长。

2.4 工作曲线

在优化的色谱条件下，分别精密量取10μL，浓度为1、10、20、30、50mg／L 的K2.2.2注入液相色谱仪进行分析。计算色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，K2.2.2含量为横坐标，制做工作曲线。

2.5 精密度

将12.5mg／L K2.2.2和0.5g／L脱氧葡萄糖混合，为混合样品1；将25mg／L K2.2.2和0.5g／L脱氧葡萄糖混合，为混合样品2。在优化的色谱条件下，分别将混合样品1 和混合样品2 在HPLC仪上连续进样6次，测量K2.2.2含量。计算精密度。

2.6 回收率

在两个混合样品中分别加入0.495 mg 和0.972mg K2.2.2对照品，用HPLC测定样品中K2.2.2的含量，计算回收率。

2.7 测定方法比较

对4批18F－FDG 注射液分别采用紫外分光光度法和HPLC法测定其K2.2.2含量，比较两种方法的测定结果。

3 结果与讨论

3.1 HPLC流动相的确定

对比5种流动相下色谱柱上脱氧葡萄糖的保留和色谱图上K2.2.2峰，可以看出，以V（50 mmol／L乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1 为流动相时，脱氧葡萄糖在色谱柱上无保留，并可检出K2.2.2色谱峰，其余4种流动相在本实验条件下未检出K2.2.2色谱峰。因此，选择V（50mmol／L乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1为流动相。

3.2 HPLC流速的影响

当流速为1.0、0.5mL／min时，K2.2.2的 保留时间分别为1.66min和3.22min，因此，将流速确定为0.5mL／min。

3.3 HPLC测定波长的选择

在吸收波长210、215、220nm 处，K2.2.2吸收峰面积分别为706 707、401 264、147 987。可以看出，检测波长 为210nm 时，K2.2.2吸收峰 面积较大，此时方法的灵敏度较高。因此，确定检测波长为210nm。

3.4 最佳条件下的色谱分析

选用V（50 mmol／L 乙酸铵）∶V（乙腈）＝1∶1为流动相，流速为0.5 mL／min，检测波长为210nm，100 mg／L K2.2.2对照品和18F－FDG注射液的HPLC分离结果分别示于图1和图2。由图1和图2可见，K2.2.2对照品和18F－FDG 注射液中测定的K2.2.2保留时间基本一致，说明检测体系适应性较好。

图1 K2.2.2对照品的HPLC谱图

3.5 工作曲线

在选定的HPLC条件下测定K2.2.2样品，得到的工作曲线示于图3。对图3进行线性拟合，线性回归方程为y＝265 939.4x＋7 490.7，γ＝0.999。表明本分析方法在K2.2.21～50mg／L范围内线性良好。检出限为0.5mg／L。

图2 18F－FDG注射液中K2.2.2的HPLC谱图

图3 工作曲线

3.6 精密度

精密度结果列于表1。由表1可知，K2.2.2HPLC谱峰面积的精密度小于3.5%。说明该方法精密度良好。

表1 精密度

3.7 回收率

当混合样品中定量加入K2.2.2对照品为0.495、0.972μg时，K2.2.2含量测定值分别为0.475、0.975μg，回收率分别为96.0%、100.3%，表明该方法回收率良好。

3.8 测定方法比较

分别采用紫外分光光度法和HPLC 法对4批18F－FDG 注射液中K2.2.2的含量进行测定，结果列于表2。

紫外分光光度法测定K2.2.2时，由于有干扰物的影响，使测量结果偏高。

表2 两种方法测定结果

4 结论

采用HPLC法可以定量分析18F－FDG注射液中微量的K2.2.2，方法的线性范围为1～50mg／L，γ＝0.999，检出限为0.5 mg／L，回收率为96.0%～100.3%。本方法的干扰因素少，与紫外分光光度法相比更准确、灵敏、用样量少，适用 于18F－FDG注射液中微量K2.2.2含 量 的测定。

［1］Chaly T，Dahl JR.Thin layer chromatographic detection of Kryptofix 2.2.2in the routine synthesis of［18F］2－Fluoro－2－deoxy－D－glucose ［J］.Nucl Med Biol，1989，16：385－387.

［2］Nakao R，Ito T，Yamaguchi M，et al.Simultaneous analysis of FDG，ClDG and Kryptofix 2.2.2in［18F］FDG preparation by high－performance liquid chromatography with UV detection［J］.Nucl Med Biol，2008，35：239－244.

［3］Ma Y，Huang BX，Channing MA，et al.Quantification of Kryptofix 2.2.2in 2－［18F］FDG and other radiopharmaceuticals by LC／MS／MS ［J］.Nucl Med Biol，2002，29：125－129.

［4］张晓军，李云刚，刘健，等.液质联用法测定常用18F药物中Kryptofix 2.2.2的含量［J］.同位素，2011，24（3）：188－192.

［5］花宁，陈立光.气相色谱法直接测量18F－FDG 中Kryptofix 2.2.2的含量［J］.同位素，2007，20（2）：105－107.

［6］赵贵植，龙卫忠，李大康，等.分光光度法测定18FFDG 中的K2.2.2［R］.北京：原子能出版社，1997.