四种检测法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比较

胡洪华 蒋 婷 宋海星 胡瀚丹

1.成都医学院检验医学院，四川成都 610083；2.成都医学院生物医学系，四川成都 610083

四种检测法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比较

胡洪华1蒋 婷1宋海星2▲胡瀚丹1

1.成都医学院检验医学院，四川成都 610083；2.成都医学院生物医学系，四川成都 610083

目的比较四种方法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的检测效果，建立一种能快速检测去蛋白率的方法。 方法用乙腈沉淀法去除血清蛋白，分别应用四种不同的检测分析方法，方法Ⅰ通过真空冻干；方法Ⅱ通过真空干燥；方法Ⅲ通过设立对照调零；方法Ⅳ通过挥干乙腈，分析血清蛋白的去除率。 结果 方法Ⅰ和方法Ⅱ耗时长、设备要求高；方法Ⅲ耗时最短、方法简便；方法Ⅳ耗时较短、但容易产生实验误差，方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白去除率结果比较，差异无统计学意义（P>0.05），与方法Ⅳ比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 方法Ⅲ为最佳的分析测定分析方法，可用于快速方便了解乙腈的去蛋白率。

乙腈沉淀法；血清蛋白；去蛋白率

研究表明血清中有20多种高丰度蛋白质，占血清总蛋白的80%以上，而对疾病诊断有密切关系的蛋白含量甚微[1]。在检测过程中血清高丰度蛋白质不仅会掩盖许多重要低丰度蛋白质，还会相对减小低丰度蛋白质的上样量，使得低丰度蛋白质的难分离纯化[2]。在进行蛋白组研究中，对血清样本进行预处理，去除血清中的高分子量、高丰度蛋白质，排除它们对低丰度蛋白质的掩盖作用，促进低丰度蛋白质的检出很有必要。目前常用的去蛋白技术有蛋白质沉淀法、亲和技术、色谱技术等[3]。蛋白质沉淀法是一种快速蛋白质去除方法，乙腈沉淀法能去除血清中高丰度蛋白,是一种简便、经济、有效的前期处理方法[4]。快速检测出乙腈的去蛋白率在研究中显得十分必要，本研究旨在探索一种新的快速的检测方法检测其去蛋白率。

1 材料与方法

1.1 材料

血清标本来源于GIBCO公司生产的小牛血清；乙腈（ACN）为美国sigma公司生产；吸光度检测仪为ND-1000分光光度计；Block Heaters GL-50为海门市其林贝尔仪器有限公司生产；高速冷冻离心机为Eppendorf公司产品；真空冷冻冻干系统为美国Themo公司产品。

1.2 方法

从-80℃取出血清于4℃条件下解冻，解冻后，用超纯水稀释成5倍和25倍共3个待测血清样本。每个样品进行4次平行试验，每个待测浓度按四种分析方法进行分析检测，分别计算每种分析方法的去蛋白率。见表1。

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，组间分析比较采用配对样本t检验，去蛋白率的比较采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察结果

去除蛋白后的上清液较去除蛋白前比较颜色明显变淡，干燥后的样本有黄色固体物附着于管壁，用超纯水溶解于1.5 mL的EP管中，溶液澄清透明，如水样。其颜色深浅与蛋白浓度成正相关。

2.2 四种方法提取成功结果及耗时比较分析

四种方法对三种不同浓度的样本进行去蛋白的处理，每个样本进行四次独立实验，分别检测其去蛋白率。分析四种方法的实验成功率和耗时，四种方法的成功率均为100%，四种方法的耗时差异明显，方法Ⅲ通过建立实验对照组，通过调零，方便、快捷、耗时短（表 2）。

表1 检测方法

表2 四种方法提取的实验结果

2.3 紫外分光光度法检测蛋白浓度

四种方法对三种不同浓度的样本进行去蛋白处理，通过紫外分光光度法检测样品去蛋白前后的蛋白浓度，并通过4次复实验分析去蛋白前后的蛋白浓度（表3）。

表3 紫外分光光度法检测分析个样本的蛋白浓度（±s，ng/μL）

表3 紫外分光光度法检测分析个样本的蛋白浓度（±s，ng/μL）

编号 样品浓度 去蛋白前蛋白浓度 去蛋白后蛋白浓度方法Ⅰ方法Ⅱ方法Ⅲ方法Ⅳ高中低高中低高中低高中低45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 45.27±0.48 9.14±0.16 1.81±0.01 0.97±0.04 0.28±0.05 0.13±0.03 0.91±0.07 0.30±0.02 0.18±0.09 0.37±0.07 0.17±0.11 0.01±0.01 3.36±0.06 1.38±0.07 0.52±0.06

2.4 去蛋白率的分析

方法Ⅰ、Ⅱ和方法Ⅳ相比，差异无统计学意义（P>0.05），与方法Ⅲ比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.5 标本蛋白浓度对去蛋白率影响的分析

标本蛋白浓度对去蛋白率的影响应用标本蛋白浓度的单因素方差分析表明，差异无统计学意义（P>0.05）。可见标本蛋白浓度因素对去蛋白率无影响。

3 讨论

质谱鉴定蛋白技术已经比较成熟，样品有一定的纯度和浓度是得到比较准确的结果的前提条件，而高丰度蛋白的存在必然严重干扰小分子蛋白质的分离检测和鉴定[5]。理想的蛋白质去除技术应该是具有选择性的,即能100%地去除不需要研究的高丰度蛋白质，同时又对拟研究的小分子蛋白质的含量或活性不产生影响[6-7]。乙腈去蛋白质法是一种快速的去除杂质蛋白质的方法，在研究中即时知道乙腈的去蛋白效果是每位研究者急切关注的问题。

综合以上四种检测乙腈去除高丰度蛋白质的方法，可以看出方法Ⅰ是种参考方法，通过低温冻干的方式将含低丰度蛋白质的溶液冻干，再用超纯水复溶检测计算乙腈的去蛋白率。方法Ⅱ是一种常用方法，但其耗时较长。方法Ⅳ通过挥干的方式去掉溶剂，在实验过程中对设备的要求较高且容易产生实验误差。本研究提示方法Ⅳ与其他方法相比，蛋白检测率差异明显，差异有统计学意义（P<0.05）。通过比较，结果提示在实验中通过建立对照组，在紫外法检测蛋白浓度时使用对照调零去除乙腈对的干扰，可快速检测出乙腈的去蛋白效果。

[1]Steel LF，Trotter MG，Nakajma PB，et al.Efficient and specific removal of album in from human serum samples[J].Mol Cell Proteomics，2003，2（4）：262-270.

[2]Adkins JN，Varnum SM，Auberry KJ，et al.Toward a human blood serum proteome analysis by multid in ensional separation coupled with mass spectrometry[J].Mol Cell Proteomics，2002，1（12）：947-955.

[3]覃健，张志勇，何敏，等.两种去除血清高丰度蛋白方法的比较[J].预防医学情报杂志，2010，26（4）：322-324.

[4]覃健，胡天桥，张志勇，等.乙腈沉淀法去除人血清中高丰度蛋白的探索性研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（5）：963-964.

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Comparison of four method for removing serum protein by acetonitrile precipitation

HU Honghua1JIANG Ting1SONG Haixing2▲HU Handan1
1.School of Laboratory Medicine,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China;2.Department of Biomedical Sciences,Chengdu Medical College,Sichuan Province,Chengdu 610083,China

Objective To compare the test effect of serum protein removal rate by acetonitrile precipitation with four different methods,the aim is to establish a rapid test method to detect the serum protein removal rate.Methods The serum proteins were removed by acetonitrile precipitation experiments,and applied for four different detection methods,vacuum freeze-drying(methodⅠ),vacuum drying(methodⅡ),controlled through the establishment of zero(method Ⅲ),dryness acetonitrile(methodⅣ)were detected the serum protein removal rate in respect.Results MethodⅠand methodⅡwere time-consuming and higher equipment requirements,while methodⅢwas time-saving and simple,although methodⅣwas time-saving,it was prone to experimental error,methodⅠ,Ⅱ andⅢ proteins removal results revealed no significant difference (P>0.05)compared with methodⅣ,which had statistically significant difference (P<0.05).Conclusion MethodⅢis the best analysis of measurement and analysis method,and can be used to understand the removal quickly and easily.

Acetonitrile precipitation;Serum proteins;Protein removal rate

R446.1

A

1673-7210（2012）08（b）-0085-02

成都医学院创新性实验项目（CX2010013）。▲

2012-03-28 本文编辑：谷俊英）