治疗骨质增生疼痛中药酒的指纹图谱研究

段梅莉* 石 慧 吴海波 李 卉 黄丽瑛 李建其*

（1 华东理工大学，上海 200237；2 上海医药工业研究院，上海 200437）

骨质增生引起的肩周炎等各种疼痛是中老年常见疑难病症，尚无特效的西药医治，临床常用的镇痛药有对乙酰氨基酚（扑热息痛）、非甾体抗炎药等缓解镇痛病情的药物[1]。虽有针灸、按摩牵引等疗法，但存在复发率高的缺点[2,3]。由于中药治疗效果较好，近年来以中药治疗骨质增生疼痛渐成主流[4-6]。

本文中治疗骨质增生疼痛的中药方剂是以药酒形式给药[7]。该药酒饮用量低（1～5mL/次），起效快，药效高且持久。我们以药酒为原料，浓缩后用溶剂萃取法分离其组成，对得到的各分离相进行镇痛活性测试，并用HPLC、NMR图谱对有较好活性的水相AD进行鉴定分析。并且将相同中药方剂的水提药液浓缩，测试用溶剂萃取法得到的水相WP，通过该方剂药酒和水提药液镇痛活性的比较，分析评价了它们之间的区别。

1 实验部分

1.1 实验材料

将中药红花、紫草、草乌、川乌、乌蛇、乌梅及双花按照一定配比用高度白酒浸制而成药酒；按照相同中药配方，用水煎煮而成水提药液；AR级无水乙醚，石英砂，上海凌峰化学试剂有限公司；95%乙醇，上海振兴化工一厂；CP级正丁醇，上海菲达工贸公司。

1.2 分析方法和仪器

美国Waters 2795高效液相色谱仪，HPLC色谱柱为Xterra-C18（2.1×150mm，5μm），流动相为0.05%TFA水溶液/0.05%TFA的乙腈溶液，样品流速为0.2mL/min，柱温30℃，检测光波长247nm。德国BRUKER AVANCE 500超导傅立叶变换核磁共振波谱仪，NMR样品制备以D2O为溶剂。镇痛活性采用醋酸扭体法和热板法进行测试。

2 实验结果和讨论

2.1 药酒的浓缩分离

用白酒浸制的方剂药液呈紫红色透明状液体。将500mL药酒浓缩后得到6.0g的褐色黏稠膏状物，加入200mL的蒸馏水搅拌，按由低到高的极性顺序用有机溶剂乙醚、氯仿和正丁醇逐级进行萃取。各萃取相浓缩后的质量及其含量百分比见表1，可明显看出水相AD是药酒中含量最高的一个组分，占总量的70%～80%。

表1 药酒的溶剂萃取相含量百分比

2.2 药酒分离相的镇痛活性评价

药酒经溶剂萃取得到的乙醚相、氯仿相以及正丁醇相均难溶于水，采用灌胃给药的方式进行试验，水相采用皮下给药的方式对小老鼠进行了镇痛活性试验，具体数据见表2、表3。结果显示，氯仿相和正丁醇相均无镇痛活性；乙醚相有镇痛作用，但兼具致痛作用；药酒中水相AD由表1可知是各萃取相中含量最多的组分，而且AD易溶于水，采用皮下给药的方式对小老鼠进行的镇痛活性试验结果显示，AD在所测剂量范围和给药方式下对扭体法和热板法的实验都有效，具有较好的镇痛作用。因此，水相AD指纹图谱的确定应是药酒质量标准研究的重点。

表2 扭体法测定各萃取相镇痛活性的结果

表3 热板法测定各萃取相镇痛活性的结果

2.3 药酒水相AD的HPLC分析

HPLC指纹图谱分析选用Xterra-C18色谱柱，适用于强极性物质的分离。为保证溶液的均一性，对每个样品采取了两次进针的原则，得到的HPLC谱图见图1。浸制1个月和3个月的药酒中水相样品进针后2～6min，10～12min，13～18min以及24min的出峰有4组，这些曲线基本保持一致，重复率高，稳定性好。这些结果表明，HPLC的测定方法可以作为治疗骨质增生疼痛中药方剂的药酒质量评估指纹图谱的分析。

图1 药酒水相AD（浸制1，3个月）的HPLC谱图

2.4 药酒水相AD的NMR分析

图2 水相AD的1H-NMR谱图

图3 水相AD的13C-NMR谱图

将AD经短的硅胶柱（流动相为95%的乙醇）过滤并浓缩后得到黄褐色黏稠状的固形物。以D2O为溶剂制成褐色透明的NMR样品，对AD的1H-NMR和13C-NMR谱图分析分别如图2和图3所示。图1中，主要吸收峰的化学位移多集中在3.2～3.8ppm（-CH2-OH、-CH2-OR）区域，还有少量位于1.1～1.4，1.8～2.2ppm区域的（烷基）吸收峰，几乎未出现6～8ppm芳香烃类的特征峰。图2中，吸收峰主要集中在60-80ppm（C-O、C-O-R）区域，还有7～8个中强峰位于80～150ppm区域。此外25～45ppm区域也有几个弱的吸收峰，没有出现180ppm以上的羰基、羧基等官能团的特征峰。因此可基本排除水相AD中具有芳烃骨架的黄酮类、醌类以及脂肪酸等化合物的大量存在，推测水相AD组分中主要含有一些多糖-寡糖类化合物。

2.5 水提药液的浓缩分离及其镇痛活性评价

将与药酒同等量的中草药用传统方法煎煮后过滤，得到了褐色的水提药液。将水提药液浓缩后得到3.2g的黑褐色固形物。加入200mL的蒸馏水，按由低到高的极性顺序用有机溶剂乙醚和正丁醇逐级进行萃取。各萃取相的质量及其含量百分比见表4，可以看出，水相WP仍然是水提药液中含量最高的一个组分，占总量的80%～90%。

表4 水提药液的溶剂萃取相含量百分比

水相WP的镇痛活性测试，只对扭体法实验有效，对热板法无效。在所测剂量范围和给药方式下水相WP显示了较弱的镇痛活性，数据见表5。

表5 扭体法WP镇痛活性的参数

3 小 结

治疗骨质增生疼痛中药方剂的药酒，与方剂的水提药液相比，前者浓缩物的重量大约是后者的两倍。药酒水相AD的质量也大约是水提药液水相WP的2倍，而且水相AD的镇痛活性明显高于水相WP。结果说明治疗骨质增生疼痛中药方剂的药酒，从镇痛活性有效成分的含量和药用效果来看，都明显优于水提药液。因此治疗骨质增生疼痛中药方剂的配制，应以高度白酒浸制为基准，不能以水替酒。

通过不同浸制时间药酒水相AD的HPLC谱图曲线对比，曲线基本保持一致，重复率高，稳定性好，表明用HPLC再辅以操作简便的IR指纹图谱分析可以成为治疗骨质增生疼痛中药方剂药酒的质量检测方法。

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