高脂血症性胰腺炎患者代谢组学研究

赵严 贾蓉蓉 胡国勇 王兴鹏 邱云平 苏明明 贾伟

高脂血症性胰腺炎患者代谢组学研究

赵严 贾蓉蓉 胡国勇 王兴鹏 邱云平 苏明明 贾伟

核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance, NMR)、气相色谱-飞行时间质谱(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF MS)等是当前代谢组学的主要分析手段。与核磁共振波谱相比，GC-TOF MS法兼具色谱的高分离效率和质谱的高分辨率，且拥有较完备的质谱数据库用于代谢物鉴定,因而在代谢轮廓分析中日益受到重视。在我国，由于饮食结构的改变，高脂血症性(主要是高三酰甘油)胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HLP)已经成为急性胰腺炎(AP)的常见病因之一[1]。本研究采用GC-TOF MS分析正常人、HLP患者血清代谢组特性，利用正交偏最小方差判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)法进行数据处理,辨识各组间代谢物质的差异。

一、材料与方法

1．研究对象：收集2006年10月至2009年3月山西医科大学附属第一医院及上海交通大学医学院附属第一医院收治的24例HLP患者。选择与患者年龄、性别等相匹配的39例健康者作为对照。HLP诊断依据中华医学会消化病学分会胰腺病学组制定的标准[2]：(1)具有AP临床表现；(2)入院时(治疗前)血三酰甘油(TG)≥11.3 mmol/L，或TG5.6～11.3 mmol/L且血清呈脂浊；(3)排除胆道疾患、酗酒、药物、肿瘤、外伤等病因。

2．方法：入院24 h内采取血液标本，检测血常规、血脂、电解质、肾功能、血气分析、血糖、血钙、肝功能、CRP等指标。同时留取一份血液，分离血清，置-80℃保存，待GC-TOF MS分析。

患者以及健康者均签署知情同意书，详细说明本研究的目的和方法。在样本收集前一天要求食用清淡饮食，避免海鲜以及辛辣食物，并禁止采样前一天喝酒与吸烟，以减少食物对代谢造成的波动。

3．GC-TOF MS：100 μl血清分别加入内标氯苯丙氨酸水溶液(0.3 mg/ml)和十七烷酸(1 mg/ml)溶液各10 μl,用甲醇∶氯仿(3∶1)300 μl提取代谢物，取上清300 μl真空浓缩干燥。干燥后用15 mg/ml吡啶溶剂的甲氧胺80 μl和80 μl N-O-双(三甲硅基)氟乙酰胺[Bis(trimethylsilyl) trifluoroace-tamide, BSTFA)，含1% TMC]进行两步反应，室温下放置1 h后进样分析。

气相色谱-飞行时间质谱仪为美国Leco公司(Pegasus HT)产品，DB-5 ms气相毛细管色谱柱购自安捷伦科技有限公司。MS分析条件：气相升温程序为80℃初温2 min，以10℃/min的速率升至180℃，再以5℃/min的速率升至240℃，以25℃/min速率升至290℃，保留9 min。

4．统计学处理：采用Matlab软件进行谱峰的判别和提取，将保留时间、质荷比和峰强度组成三维矩阵表，导入到SIMCA软件进行多维统计分析。多维统计分析得到的差异变量通过商品化NIST化合物库进行检索，寻找匹配度、质谱图等参考化合物。利用已建立好的标品库对参考化合物进行验证，从而确定所寻找的差异代谢物[3]。

二、结果

1．HLP患者血清的OPLS-DA分析：HLP患者血清的OPLS-DA模型区与健康者的OPLS-DA模型区能完全区分开(图1)。

图1 健康者(▼)及HLP患者(▲)的血清OPLS-DA图

2．HLP患者与健康者血清代谢物质的差异： HLP患者与健康者血清的差异性代谢物质有4种，其中参与氨基酸代谢的丙氨酸(Alanine)、参与能量代谢的柠檬酸(Citrate)及延胡索酸(Fumaric acid)水平下降，参与脂肪酸代谢的十八烷酸(Octadecanoic acid)水平升高。

讨论GC-TOF MS以其分辨率高、响应快、适于痕量分析等特点广泛应用于食品安全、农药残留、药物滥用和人体新陈代谢物质等分析领域。我们前期的代谢组学研究显示，HLP患者和健康者尿样的代谢图谱完全不同[3]。尿样有取样方便，对人体完全无创的优点，但易受到饮食、饮水量以及肾脏功能等方面影响。为了更全面而又更加稳定地获取HLP相关代谢通路的变化，本研究检测血清代谢组学，并与尿样中得到结果进行相互验证和补充。

本研究结果显示，HLP患者血清丙氨酸、柠檬酸、延胡索酸等代谢物水平显著低于健康者，而十八烷酸显著高于健康者，与前期尿液中差异代谢物的结果一致[3]。Bohus等[4]亦报道，以L-精氨酸诱导SD大鼠胰腺炎模型后，与三羧酸循环相关的中间代谢产物如：柠檬酸、a-同戊二酸、琥珀酸、延胡索酸等水平下降。柠檬酸和延胡索酸作为三羧酸循环中的主要中间代谢物质，它们的下降可能预示着HLP患者能量代谢中有氧呼吸的下调,表明有氧呼吸能量代谢的降低与HLP的关系密切。三羧酸循环发生于细胞的线粒体中，因此三羧酸循环底物的改变与机体的线粒体功能改变相关。王艳蕾等[5]在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠模型证实，胰腺细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性下降。因此维持线粒体功能，减轻胰腺亚细胞器功能的损害，可以改善HLP患者的预后。

三酰甘油的代谢产物游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)可引起或加重AP病情。本研究发现，HLP患者血清中多种饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸，如十八烷酸、二十烷酸、棕榈酸等水平升高。杨佳芳等[6]曾报道，高三酰甘油血症能引起ANP大鼠与脂质代谢相关的基因，如脂肪酸易位酶、脂肪酸结合蛋白、脂质代谢酶等表达下调，导致脂质代谢异常。但这些代谢物的生化意义还有待于进一步研究。

[1] 黄开红,林萍,聂胜利,等.广东地区1316例急性胰腺炎的临床流行病学特征.中华内科杂志,2007,46:831-834.

[2] 中华医学会消化病学分会胰腺病学组.中国急性胰腺炎诊治指南.中华消化杂志,2004,24:190-192.

[3] 赵严,吴建兵,潘立,等.高脂血症性胰腺炎患者尿样的代谢组学.中华胰腺病杂志,2009,9:85-88.

[4] Bohus E,Coen M,Keun HC,et al.Temporal metabonomic modeling of L-arginine-induced exocrine pancreatitis.J Proteome Res,2008,7:4435-4445.

[5] 王艳蕾,贾玉杰,姜妙娜,等.栀子对重症急性胰腺炎胰腺细胞结构和功能的影响及其与内毒素氧自由基的关系.陕西医学杂志,2007,36:22-24.

[6] 杨佳芳,王兴鹏,吴恺.高脂血症引起急性胰腺炎大鼠基因表达变化.中华消化杂志，2007,5:322-325.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.016

国家自然科学基金(30971359)；国家863计划(2009AA02Z116)

200072 上海，同济大学附属第十人民医院 上海市第十人民医院消化内科(赵严、贾蓉蓉、胡国勇、王兴鹏)；上海交通大学药学院(邱云平、苏明明、贾伟)

王兴鹏，Email:wangxp1965@yahoo.com.cn

2012-02-14)

(本文编辑：屠振兴)