DNA甲基转移酶3b在人胰腺癌组织中的表达及其意义

徐岷 姚志新 朱立宁 徐萍 周志华 龚燕芳 满晓华 吴莺 张尤历

·论著·

DNA甲基转移酶3b在人胰腺癌组织中的表达及其意义

徐岷 姚志新 朱立宁 徐萍 周志华 龚燕芳 满晓华 吴莺 张尤历

目的检测人胰腺癌组织中DNA甲基化转移酶3b(DNMT3b)的表达，分析其与肿瘤临床病理特征的相关性。方法应用蛋白质印迹法检测12例配对人胰腺癌和癌旁组织中DNMT3b的表达；免疫组织化学法检测59例胰腺癌组织中DNMT3b的表达，并分析其与肿瘤临床病理特征的相关性。结果蛋白质印迹法结果显示，胰腺癌及癌旁组织DNMT3b蛋白表达量分别为0.69±0.13和0.14±0.03，癌组织的表达量明显高于癌旁组织(t=4.464，P<0.05)。免疫组化结果显示，胰腺癌组织DNMT3b阳性高表达率为59%，癌旁组织阴性表达。肿瘤组织DNMT3b表达强度与TNM分期和淋巴结转移相关。结论DNMT3b在胰腺癌组织中高表达，其表达与肿瘤的恶性生物行为有关。

胰腺肿瘤； 甲基化； DNA甲基转移酶3b

表观遗传异常是肿瘤发生、发展的重要因素之一，它常通过DNA的甲基化、RNA表达沉默和组蛋白修饰3种方式调控基因的表达。DNA的甲基化需要DNA甲基转移酶(DNA methltransferases, DNMTs)的催化，DNMT活性增高是肿瘤细胞一个具有特征性的早期分子改变，它在人类肿瘤细胞中普遍呈高表达状态，并导致众多抑癌基因CpG岛异常高甲基化[1]。DNMT3b是在细胞内建立新的DNA甲基化类型所必需[2]。本研究检测胰腺癌和癌旁组织中DNMT3b的表达，分析DNMT3b表达与肿瘤临床病理特征的相关性，了解其在胰腺癌发病机制中的作用。

材料与方法

一、组织标本

收集上海长海医院2008年5月至2011年2月手术切除的新鲜胰腺癌组织及相应癌旁组织12例。其中男性7例，女性5例，年龄46～81岁，平均(63±10)岁；中分化腺鳞癌2例，中分化导管腺癌9例，低分化导管腺癌1例。另收集2007年12月至2011年5月胰腺癌石蜡包埋组织标本47例，其中男性30例，女性17例，年龄31～78岁，平均(60±10)岁；中分化导管腺癌41例，低分化导管腺癌1例，中分化腺鳞癌1例，中分化黏液腺癌4例。所有患者术前均未接受放疗及化疗。

二、蛋白质印迹法检测DNMT3b表达

取新鲜胰腺癌及癌旁组织，应用蛋白提取试剂盒(BestBio公司)提取蛋白并定量。常规行蛋白质印迹法检测DNMT3b表达。鼠抗人DNMT3b单克隆抗体(Abcam公司)工作浓度1∶250，鼠抗人β-actin单克隆抗体(Santa cruz公司)工作浓度1∶2000，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育后ECL显影，用SAGECREATION分析软件成像及分析条带灰度，以目的条带与内参β-actin的灰度比值表示蛋白的表达水平。

三、免疫组织化学法检测DNMT3b表达

采用UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒(Maixin-bio公司)常规行免疫组化染色，按说明书操作。抗DNMT3b一抗工作浓度1∶500。以PBS代替一抗作为阴性对照。由病理科医师进行独立阅片，并以双盲法评分。DNMT3b定位于细胞核，阳性染色为棕黄色。根据核染色强度和阳性细胞百分率进行评分：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分；无阳性细胞为0分，阳性细胞<10%为1分，10%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。两评分相乘，0～6分为低表达，8～12分为高表达[3]。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺癌和癌旁组织DNMT3b蛋白表达

蛋白质印迹法结果显示，胰腺癌及癌旁组织DNMT3b蛋白表达量分别为0.69±0.13和0.14±0.03(图1)，癌组织的表达量明显高于癌旁组织(t=4.464，P<0.05)。

图1 胰腺癌组织(T)及癌旁组织(N)中DNMT3b表达

免疫组化结果显示，59例胰腺癌组织DNMT3b阳性高表达率为59%(35/59)，癌旁组织未见阳性细胞(图2)。

图2 胰腺癌(a)及癌旁组织(b)DNMT3b表达(免疫组化 ×400)

二、胰腺癌DNMT3b表达与肿瘤临床病理特征的关系

胰腺癌组织DNMT3b的表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤部位、大小、浸润范围、病理分型、分化程度均无关(表1)。

讨 论

DNA甲基化的改变能够影响与细胞生长、分化、转化和凋亡等相关基因的转录，不但在细胞固有功能和正常细胞的生长过程中起着重要作用，而且也是肿瘤发生、发展的重要因素[4]。催化这一过程的是DNA 甲基转移酶(DNMTs)，其中DNMT3包含两个主要成员：DNMT3a和DNMT3b，主要参与从头甲基化，以非甲基化的DNA为模板，催化新的甲基化位点形成[5]。

表1胰腺癌DNMT3b的表达与临床病理特征的关系

临床参数例数DNMT3b高表达低表达χ2值P值性别 男3720171.1410.285 女22157年龄(岁) ≤509632.2170.330 51～591679 ≥60342212肿瘤位置 胰头3822160.0900.764 胰体尾21138肿瘤直径 ≤4cm4124170.0340.853 >4cm18117侵及范围 T1a5411.6930.639 T1b201010 T2261610 T3853病理分型 腺鳞癌3121.2490.536 黏液腺癌431 导管腺癌523121TNM分期 Ⅰ176119.1370.028 Ⅱ20119 Ⅲ20164 Ⅳ220分化程度 中分化5734230.0750.785 低分化211淋巴转移 有211746.3220.012 无381820

DNMT3b在胚胎细胞中位于染色质，在细胞成熟后散在分布，在功能上起促进胚胎全程从头甲基化的作用。有研究表明，DNMT3b在多种人类肿瘤中过表达[6]，在癌前病变向癌的转变过程中也发现DNMTs表达增强[7]。DNMT3b在结肠癌中靶向许多重要的抑癌因子和转录因子，特别是结肠癌的HOXB13基因上游CpG岛甲基化[8]。结肠癌组织HOXB13过量表达能够上调Igf2表达和沉默癌抑制基因Sfrp2、Sfrp4和Sfrp5的转录[9]。DNMT3b还具有管理PRC1的功能[10]。DNMT1和DNMT3b还可以调节组蛋白修饰，通过聚集CTCFL/BORIS活化BAG-1基因和调节组蛋白启动子甲基化[11]。敲除DNMT1和DNMT3b可以增加CXCR4在转录和翻译水平的表达，说明在肿瘤形成过程中DNMTs起着重要的作用[12]。

本实验结果显示，胰腺癌组织DNMT3b蛋白表达显著高于其配对的癌旁组织，DNMT3b阳性高表达率为59%，说明DNMT3b可能与胰腺癌的发生发展有关。通过DNMT3b表达与肿瘤临床病理特征的分析，发现DNMT3b表达与胰腺癌TNM分期和淋巴结转移相关，提示其表达水平能够反映胰腺癌的恶性行为，可能成为判断胰腺癌预后的分子标志物及新的治疗靶点。

[1] Seeliger B, Wilop S, Osieka R, et al. CpG island methylation patterns in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma, 2009, 50:419-426.

[2] Velicescu M, Weisenberger DJ, Gonzales FA, et al. Cell division is required for de novo methylation of CpG islands in bladder cancer cells. Cancer Res, 2002, 62: 2378-2384.

[3] Mutze K, Langer R, Becker K, et al. Histone deacetylase (HDAC) 1 and 2 expression and chemotherapy in gastric cancer. Ann Surg Oncol, 2010, 17:3336-3343.

[4] Chen C, Yin N, Yin B, et al. DNA methylation in thoracic neoplasms. Cancer Lett, 2011, 301:7-16.

[5] Gray KS, Forrest JC, Speck SH. The de novo methyltransferases DNMT3a and DNMT3B target the murine gammaherpesvirus immediate-early gene 50 promoter during establishment of latency. J Virol, 2010, 84:4946-4959.

[6] Li Y, Tollefsbol TO. Impact on DNA methylation in cancer prevention and therapy by bioactive dietary components. Curr Med Chem, 2010, 17:2141-2151.

[7] Kanai Y, Hirohashi S. Alterations of DNA methylation associated with abnormalities of DNA methyltransferases in human cancers during transition from a precancerous to a malignant state. Carcinogenesis, 2007, 28:2434-2442.

[8] Ghoshal K, Motiwala T, Claus R, et al. HOXB13, a target of DNMT3B, is methylated at an upstream CpG island, and functions as a tumor suppressor in primary colorectal tumors. PLoS One, 2010, 29:e10338.

[9] Linhart HG, Lin H, Yamada Y, et al. Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novo methylation and transcriptional silencing. Genes Dev, 2007, 21:3110-3122.

[10] Jin B, Yao B, Li JL, et al. DNMT1 and DNMT3B modulate distinct polycomb-mediated histone modifications in colon cancer. Cancer Res, 2009, 69:7412-7421.

[11] Sun L, Huang L, Nguyen P, et al. DNA methyltransferase 1 and 3B activate BAG-1 expression via recruitment of CTCFL/BORIS and modulation of promoter histone methylation. Cancer Res, 2008, 68:2726-2735.

[12] Przybylski M, Kozowska A, Pietkiewicz PP, et al. Increased CXCR4 expression in AsPC1 pancreatic carcinoma cells with RNA interference-mediated knockdown of DNMT1 and DNMT3B. Biomed Pharmacother, 2010, 64:254-258.

ExpressionandroleofDNMT3binhumanpancreaticcancertissue

XUMin,YAOZhi-xin,ZHULi-nin,XUPing,ZHOUZhi-hua,GONGYan-fang,MANXiao-hua,WUYing,ZHANGYou-li.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangSuUniversity,JiangSu212001,China

ZHANGYou-li,Email:zjyouli@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of DNMT3b and its correlation with clinicopathological parameters of pancreatic cancer.MethodsThe expressions of DNMT3b protein in 12 pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were detected by Western blot. The expressions of DNMT3b protein in 59 pancreatic cancer tissues were detected by immunohistochemistry. The association of DNMT3b expression and clinicopathological parameters of pancreatic carcinoma were analyzed.ResultsWestern blot results showed the expressions of DNMT3b protein in pancreatic cancer tissues and para-cancerous tissues were 0.69±0.13and0.14±0.03, and the protein level of DNMT3b in pancreatic cancer tissues were significantly higher than that in para-cancerous tissues (t=4.464,P<0.05). Immunohistochemistry examination showed that the positive rates of DNMT3b protein were 59% in pancreatic cancer tissues and negative in para-cancerous tissues. DNMT3b expression was positively correlated with the TNM stage and lymph node metastasis.ConclusionsDNMT3b is highly expressed in pancreatic cancer tissues, and it is related with malignant biological behaviors of pancreatic cancer cells.

Pancreatic neoplasms； Methylation； DNA methyltransferase 3b

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.010

江苏省自然科学基金(BK2009210)；江苏省卫生厅科研项目(H200836)；镇江市科研计划项目(SH2009012)

212001 江苏镇江，江苏大学附属医院消化科(徐岷、姚志新、朱立宁、徐萍、吴莺、张尤历)；解放军第101医院病理科(周志华)；第二军医大学长海医院消化科(龚燕芳、满晓华)

张尤历，Email：zjyouli@yahoo.com.cn

2012-05-17)

(本文编辑：吕芳萍)