静脉输入休克大鼠肠淋巴液对正常大鼠红细胞的损伤作用*

赵自刚， 牛春雨， 李志鹏， 鲁 蓓， 司永华， 张立民， 张玉平

(河北北方学院微循环研究所，基础医学院病理生理学教研室，河北 张家口 075029)

1000-4718(2012)07-1319-05

2012-02-08

2012-05-08

国家自然科学基金资助项目(No. 30370561)；河北省自然科学基金资助项目(No. C2004000649)；河北省科技支撑计划(No. 11276103D-84)

△通讯作者 Tel: 0313-4029168; E-mail：ncylxf@126.com

·短篇论著·

静脉输入休克大鼠肠淋巴液对正常大鼠红细胞的损伤作用*

赵自刚， 牛春雨△， 李志鹏， 鲁 蓓， 司永华， 张立民， 张玉平

(河北北方学院微循环研究所，基础医学院病理生理学教研室，河北 张家口 075029)

目的观察静脉输入休克大鼠肠淋巴液对正常大鼠红细胞参数、代谢以及血液黏度的影响，探讨休克肠淋巴液对红细胞的损伤作用。方法将引流休克1～3 h的大鼠肠淋巴液离心去细胞后，以等量生理盐水稀释，经股静脉输入正常大鼠(2 mL/kg)，时间为30 min；另一组大鼠输入等量生理盐水作为对照组。输液结束后2.5 h，经腹主动脉取血，检测红细胞常规参数、三磷酸腺苷(ATP)、乳酸(LA)、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)含量、内外液离子浓度以及血液黏度等指标。结果静脉输入休克肠淋巴液降低了正常大鼠红细胞数目、血红蛋白浓度、血细胞比容和ATP含量，使红细胞平均体积、2,3-DPG和LA含量及全血还原黏度显著增高，但对红细胞内外液离子浓度、全血黏度和血浆黏度无明显影响。结论静脉输入休克肠淋巴液引起正常大鼠红细胞能量代谢障碍，从而导致红细胞体积与全血还原黏度增加，即休克肠淋巴液可损伤红细胞。

休克，出血性； 肠淋巴液； 红细胞； 血液黏度

红细胞(red blood cells,RBC)是血液的主要成分，其结构、特性、功能与血液流动性密切相关，是维持微循环稳态的重要组成部分[1]。研究表明，休克发病学中的血液流变性事件是休克临床救治的关键靶点[2]；休克后肠淋巴液回流不仅是加重组织器官损伤的重要因素[3-4]，而且结扎肠淋巴管还可减轻急性失血大鼠的血液流变性异常、改善血液凝固性[5-7]，引流休克肠淋巴液可降低失血性休克大鼠红细胞聚集指数与膜的自由基损伤、提高红细胞变形性与膜泵功能[8-9]；可见休克状态下，肠淋巴液回流是红细胞结构损伤与功能障碍的重要因素。本文在前期研究基础上，将引流的休克肠淋巴液输入正常大鼠，观察静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞参数、代谢状态以及血黏度的影响，从另一个侧面验证肠淋巴液对红细胞的损伤作用。

材 料 和 方 法

1仪器设备与试剂

3-9D型血流变、微循环、细胞变形和参数分析四用仪(成都麦赛科贸公司)，7600-110型全自动生化分析仪(日立)，FP640型火焰光度计(上海精密科学仪器有限公司),CA800型全自动血液常规分析仪(Sysmex),SpectraMax M2型多功能全自动酶标仪(MD),RM6240BD型生物信号采集系统(成都仪器厂),WZF-250F2型双道微量注射泵(浙大医学仪器有限公司),Labofuge 400R型高速低温离心机(德国科峻),NE-1000型程控微量抽注泵(New Era Pump SystemsInc.)，702型低温冰箱(美国热电)；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、乳酸(lactic acid，LA)和2,3-二磷酸甘油酸(2,3-diphosphoglycerate，2,3-DPG)试剂盒(美国/江苏希望分装)，戊巴比妥钠(德国/上海泰瑞尔分装)，肝素钠(国药集团化学试剂有限公司)。

2动物与分组

SPF级Wistar雄性大鼠[购自中国军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号为SCXK(军)2007-004]，体质量230～270 g。12只大鼠用于复制失血性休克模型，引流休克肠淋巴液(shocked mesenteric lymph，SML)；另外12只大鼠均分为对照组(静脉输入生理盐水)与休克肠淋巴液组(SML组，静脉输注SML)。所有大鼠于实验前12 h禁食，自由饮水，实验过程中动物处置符合动物医学伦理学标准。

3休克肠淋巴液制备

大鼠经1%戊巴比妥钠(0.5 mL/kg，相当于50 mg/kg)肌肉注射麻醉后，行两侧股部手术，常规方法复制失血性休克模型(40 mmHg，3 h)[10-12]。腹部手术，按我室常规方法[13-14]自维持低血压1 h起，行肠淋巴管插管，引流SML至休克3 h；将引流的SML(0.2～0.4 mL之间)2 000 r/min离心10 min，去细胞，保留淋浆，备静脉输液用。

4静脉输入休克肠淋巴液与血样留取

SML组大鼠全身麻醉后，行左侧股部手术，分离股动脉与股静脉，股动脉插管连接生物信号采集系统监测平均动脉血压(mean artery pressure，MAP)；术后稳定30 min后，将制备的SML以1∶1生理盐水稀释后自股静脉缓慢输注，量为2 mL/kg(稀释后)，持续30 min；对照组大鼠执行相同的手术，监测MAP，并以相同方法输入等量生理盐水。输液结束后持续观察2.5 h，经腹主动脉插入一次性使用真空采血器配套用针，留取血样，检测下述指标。

5红细胞常规参数检测

留取1 mL全血标本至EDTA-K2抗凝管，进行血液常规检测，记录RBC数目、血红蛋白(hemoglobin，Hb)浓度以及红细胞体积相关参数：血细胞比容(hematocrit，HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)和红细胞体积分布宽度(red blood cell volume distribution width，RDW)[包括RDW标准偏差(RDW standard deviation，RDW-SD)和RDW变异系数(RDW coefficient of variation，RDW-CV)]；同时记录反映红细胞内Hb含量的指标：平均红细胞血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)。

6血液黏度检测

留取1.5 mL全血标本至肝素抗凝管，取肝素抗凝血0.8 mL检测全血黏度，其它血样常规方法制备血浆，检测血浆黏度。结合HCT和血浆黏度，计算全血相对黏度和还原黏度。

7红细胞代谢指标检测

留取1 mL全血标本至2个EP管中，3 000 r/min 离心10 min后，吸去血浆及白细胞层，在其中1个EP管余下的红细胞中加入等体积双蒸水，置于-75 ℃低温冰箱，从低温冰箱中取出冷冻的红细胞与ddH2O混合液复温后混匀，即得红细胞膜悬液，以磷钼酸比色法(以肌酸激酶催化肌酸与标本中ATP反应产生磷酸肌酸，用磷钼酸比色法检测)[15]、脱氢法[16]分别检测红细胞悬液ATP和LA含量，应用文齐氏法检测Hb浓度，用于ATP和LA标准化；另一EP管中的红细胞直接置于-75 ℃低温冰箱，从低温冰箱中取出冷冻的红细胞复温后混匀，3 000 r/min 离心10 min，上清即为红细胞内液，以ELISA方法检测红细胞内液2,3-DPG含量。

8红细胞内外液离子浓度检测

应用全自动生化分析仪检测血浆(即红细胞外液)Na+、K+、Cl-和Ca2+浓度；将检测2,3-DPG后剩余的红细胞加1%乙酸裂解，离心取上清(即红细胞内液)，以离子电极法检测Na+和K+浓度，并应用文齐氏法检测上清液中血红蛋白浓度，进行Na+和K+浓度的标准化。

9统计学处理

结 果

1静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞参数的影响

静脉输入休克1～3 h肠淋巴液后，RBC、HCT和Hb显著降低，MCV显著升高(P<0.05，P<0.01)，见表1。

表1 静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞参数的影响

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞2,3-DPG、ATP和LA含量的影响

静脉输入休克肠淋巴液显著提高了红细胞2, 3-DPG和LA含量,降低了红细胞ATP含量(P<0.01)，见表2。

3静脉输入休克肠淋巴液对大鼠红细胞内外离子浓度的影响

静脉输入休克肠淋巴液后，大鼠血浆的Na+、K+、Cl-、Ca2+和红细胞内液的Na+、K+等指标与对照组比较均无显著差异(P>0.05)，见表3。

表2静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞2,3-DPG、ATP和LA含量的影响

Group2,3-DPG(mmol/L)ATP(μmol/gHb)LA(mmol/gHb)Control2.274±0.40010.402±1.1821.925±0.912SML6.897±1.152**8.607±0.737**3.867±0.490**

2, 3-DPG: 2, 3-diphosphoglycerate; ATP: adenosine triphosphate; LA: lactic acid.**P<0.01vscontrol group.

表3静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠红细胞内、外液离子浓度的影响

GroupExtracellularfluid(mmol/L)Intracellularfluid(mmol/gHb)Na+K+Cl-Ca2+Na+K+Control139.67±5.925.36±0.33104.86±3.672.77±0.4546.99±10.14661.84±84.68SML138.71±1.674.98±0.56104.92±2.402.53±0.0941.47±14.39726.32±114.38

4静脉输入休克肠淋巴液对大鼠血黏度的影响

静脉输入休克肠淋巴液后，各切变率下的大鼠全血黏度有增高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；全血高切、低切还原黏度显著增高(P<0.01)；全血高切、低切相对黏度和血浆黏度的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4，5。

表4静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠全血黏度的影响

Group1s-110.3s-130.7s-140.3s-1115s-1300s-1Control8.894±0.8956.459±0.6424.629±0.4604.247±0.4223.050±0.3032.644±0.265SML9.590±0.7516.888±0.5394.937±0.3864.529±0.3543.252±0.2542.840±0.222

表5静脉输入休克肠淋巴液对正常大鼠全血相对黏度、还原黏度及血浆黏度的影响

GroupRelativeviscosityReducedviscosityPlasmaviscosity1s-1300s-11s-1300s-1100s-1Control9.919±1.1122.937±0.32919.146±1.9685.670±0.5830.912±0.132SML9.544±2.2482.287±0.66626.660±2.451**7.896±0.727**1.024±0.202

**P<0.01vscontrol group.

讨 论

失血性休克后的微循环障碍和血液流变性异常，是加重组织细胞缺血、缺氧继而引起能量代谢障碍最终导致细胞损伤的重要机制。由于红细胞参与血液循环，是能量代谢障碍后损伤的首要靶细胞，且红细胞损伤是创伤失血性休克后微循环障碍的重要因素[17]，故观察休克肠淋巴液对红细胞的损伤作用，更有利于阐明肠淋巴液在休克后血液流变性异常发病学中的作用。

为了观察休克肠淋巴液对红细胞的损伤作用，本文应用最为简便的血细胞常规分析仪检测了红细胞常规参数，结果发现静脉输入休克肠淋巴液降低了红细胞数量、红细胞比积、血红蛋白，结合全血黏度与还原黏度的结果，说明其原因主要是血液稀释。休克肠淋巴液作为体外因素输入机体，其毒性成分可作为应激原引起机体一系列神经内分泌反应。我们在另一实验中观察到静脉输入休克肠淋巴液引起了正常大鼠MAP升高，说明在这一早期应激反应过程中的交感-肾上腺髓质系统兴奋引起了毛细血管流体静压轻度升高，从而使组织液回流增加，出现类似休克早期“自身输液”的现象；这也是血液稀释以及MCH、MCHC未出现统计学差异的原因。更为重要的是，静脉输入休克肠淋巴液引起了MCV增加，表明休克肠淋巴液引起了红细胞损伤，这可能与体液环境、能量代谢、离子交换、毒素等多种因素有关。为此，本文从红细胞的能量代谢与离子跨膜转移两方面探讨了红细胞损伤的机制。

本文选择了与红细胞能量代谢有关的ATP、LA、2,3-DPG等指标。结果发现，静脉输入休克肠淋巴液使红细胞中的ATP减少，LA增多，说明静脉输入休克肠淋巴液引起了有氧氧化障碍、无氧酵解增强，这种变化反映在红细胞上，进一步引起了红细胞的能量代谢障碍，而ATP减少和LA增多则成为红细胞肿胀和功能障碍的重要因素。红细胞内2,3-DPG水平是影响血红蛋白与氧亲和力的重要因素[18]，静脉输入休克肠淋巴液引起了正常大鼠红细胞内液2,3-DPG增高，其原因与休克肠淋巴液中毒性物质的刺激有关，结果提示静脉输入休克肠淋巴液代偿性增加了红细胞携氧能力。值得指出，2,3-DPG是影响氧解离曲线的重要因素之一，2,3-DPG增高可引起氧离曲线右移，降低血红蛋白与O2的亲合力，从而有利于供氧，这对于改善组织氧供是有利的；然而，LA堆积既可通过降低2,3-DPG合成引起氧解离曲线左移，又可通过H+的Bohr效应引起氧解离曲线右移，调节氧亲合力；本研究中2,3-DPG增高与LA增高的不协调变化，反映了机体损伤与抗损伤作用的斗争过程。因此，在今后的研究中，应该进一步关注氧解离曲线变化的情况，这对于阐明休克肠淋巴液回流而导致红细胞功能损伤的恶性循环将是更为有利的证据。

细胞内外离子梯度平衡，在维持细胞膜电位、容量、体温、代谢等生理活动发挥重要作用，而这一作用依赖于细胞膜上的膜泵[19]。前期研究发现，静脉输入休克肠淋巴液降低了正常大鼠红细胞膜泵的活性[8]，这对于维持细胞内外的离子转运是不利的；但本研究却未发现红细胞内外液Na+和K+浓度出现显著变化，结合观察到的MCV增加，说明其原因与红细胞内液量增多有关；此外，由于接受休克肠淋巴液的供体是正常大鼠，而观察时间较短(仅3 h)，因此有待进一步延长时间观察其作用。应当指出，本研究所观察的血浆Ca2+为血浆中游离Ca2+与结合Ca的总和，在血浆白蛋白无明显变化的情况下，反映游离Ca2+的浓度；而本研究未能观察细胞内液中Cl-与Ca2+浓度的变化，这也是本文的一个缺憾，有待在将来的研究中进一步观察。

全血黏度与红细胞数量、血浆黏度相关，血浆黏度与血液中的多种蛋白(尤其是纤维蛋白原)有关，而由于血液稀释的因素，导致静脉输入休克肠淋巴液后并未引起各切变率下全血黏度、全血相对黏度和血浆黏度的显著变化；但去除红细胞数量的影响之后，全血低切、高切还原黏度则显著增高，说明这种变化与红细胞本身因素有关，而这种变化则是红细胞体积增高所导致的。因此，红细胞损伤首先引起了全血还原黏度增高。当然，在以后的研究中，还应该延长观察时间，探讨静脉输入休克肠淋巴液是否会导致全血黏度增高进而成为血液流变性异常的关键因素。

总之，静脉输入休克肠淋巴液具有损伤红细胞的作用，其机制与红细胞能量代谢障碍有关，最终增高了全血还原黏度，从另一个侧面验证了休克肠淋巴液的毒性作用；同时，静脉输入休克肠淋巴液引起了血液稀释，表现在降低血细胞比容、红细胞数量、血红蛋白浓度，这也是红细胞内外离子浓度、全血黏度、血浆黏度、部分红细胞参数无明显变化的原因。应当指出，本研究静脉输入的休克肠淋巴液为新鲜未冻存淋巴液，是从休克大鼠引流、离心去细胞后直接应用于本研究的，可更直接反映休克肠淋巴液的作用，与国外学者所用的冷冻淋巴液不同[20]；另外，输入休克肠淋巴液的量与速度，是依据动物在体肠淋巴液回流的速度以及具体实验条件选定的，可较为准确地反映在体肠淋巴液回流的速度和过程。

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Intravenousinjectionofmesentericlymphfromshockratsdamagesredbloodcellsinnormalrats

ZHAO Zi-gang, NIU Chun-yu, LI Zhi-peng, LU Bei, SI Yong-hua, ZHANG Li-min, ZHANG Yu-ping

(InstituteofMicrocirculation,DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalInstitute,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com)

AIM: To observe the effects of intravenous injection of the mesenteric lymph from shock rats on the characteristics and metabolism of red blood cells (RBC), and blood viscosity in normal rats.METHODSThe mesenteric lymph samples, collected from the rats 1 to 3 h after hemorrhagic shock, centrifuged to remove all cellular components and diluted with equal volume of saline, were intravenously injected into normal rats at dose of 2 mL/kg through femoral vein within 30 min. The equal volume of saline was intravenously injected into other normal rats as controls. At 2.5 h after injection, the blood samples were collected from the abdominal aorta for determining the routine parameters, adenosine triphosphate (ATP), lactic acid (LA), 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG), ion concentrations of intra- and extracellular fluid of the RBC and blood viscosity.RESULTSIntravenous injection of shocked mesenteric lymph reduced the number of RBC, the concentration of hemoglobin, the hematocrit and the content of ATP. Intravenous injection of shocked mesenteric lymph significantly increased the mean corpuscular volume (MCV), 2, 3-DPG, LA in RBC and the whole blood reduced viscosity. However, no obvious effect of the injection on ion concentrations of intra- and extracellular fluid of RBC, whole blood viscosity and plasma viscosity was observed.CONCLUSIONIntravenous injection of shocked mesenteric lymph causes the disorders of energy metabolism in RBC, thus increasing the MCV and whole blood reduced viscosity. Shocked mesenteric lymph damages RBC.

Shock,hemorrhagic; Mesenteric lymph; Red blood cells; Blood viscosity

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.031