雌激素通过KATP通道影响大鼠肠系膜动脉的反应性*

张登文, 徐 林, 张传汉, 韩爱迪, 姚文龙, 王学仁

(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北 武汉 430030 )

1000-4718(2012)07-1176-05

2012-01-07

2012-03-16

教育部博士点基金新教师资助项目(No.20070487131)；湖北省卫生厅青年科技人才基金资助项目(No.QJX2008-1)

△通讯作者 Tel:027-83663173;E-mail: xrwang@mail.hust.edu.cn

▲并列第1作者

雌激素通过KATP通道影响大鼠肠系膜动脉的反应性*

张登文▲, 徐 林▲, 张传汉, 韩爱迪, 姚文龙, 王学仁△

(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，湖北 武汉 430030 )

目的观察雌激素对大鼠肠系膜动脉平滑肌ATP敏感性钾离子通道 (KATP通道)mRNA表达的影响，探讨KATP通道在雌激素调节大鼠肠系膜血管反应性中的作用。方法雌性SD大鼠48只，体重(100±10) g，随机分为假手术组(sham)、卵巢切除组(Ovx)和卵巢切除后补充雌激素组(Ovx +E)。采取实时荧光定量PCR检测大鼠肠系膜动脉中KATP通道mRNA的表达；观察各组大鼠肠系膜动脉对去甲肾上腺素(NE)升压效应的反应性。结果与sham组相比，Ovx组大鼠肠系膜动脉KATP通道的Kir6.1及SUR2B亚单位mRNA表达减少(P<0.05)，而Ovx+E组则表达增加(P<0.05)。与sham组相比，Ovx组大鼠的血管反应性明显增加(P<0.05)，Ovx+E组无明显差异。给予KATP通道阻滞剂格列本脲后，sham组和Ovx+E组的动脉反应性增加(P<0.05)，Ovx组无明显变化(P>0.05)，此时3组间比较无明显差异(P>0.05)。结论雌激素可能通过上调肠系膜动脉平滑肌细胞KATP通道的表达来降低动脉对去甲肾上腺素升压效应的反应性。

雌激素； ATP敏感性钾离子通道； 血管反应性； 去甲肾上腺素

流行病学研究发现，绝经前女性的冠心病及卒中发生率比同龄男性低，到绝经后其发病率迅速增高[1]。而冠心病及卒中主要是由高血压和动脉硬化等导致血管功能受损的一类疾病所引起，这种血管功能损害主要表现为血管收缩功能增强、舒张功能减弱。既往研究表明，绝经后雌激素的缺乏导致血管功能发生了这一系列的变化。

ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive K+channels, KATP通道)是一种内向整流性钾通道，广泛分布于心肌细胞、胰岛β细胞、骨骼肌细胞、血管与非血管平滑肌细胞和神经细胞等多种细胞中。血管平滑肌中KATP通道开放可以引起血管舒张，它广泛参与了多种血管活性药物对血管功能的调节以及休克时血管功能变化[2]。然而雌激素对血管功能的影响是否有KATP通道参与目前尚不清楚。 因此，本研究采用卵巢去势及雌激素干预模型，real-time RT-PCR技术检测大鼠肠系膜动脉平滑肌中KATP通道表达的变化，观察KATP通道阻滞剂对大鼠去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)升压效应的影响。

材 料 和 方 法

1动物

雌性SD大鼠48只，体重(100±10) g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，随机分为3组，假手术组(sham)、卵巢切除组(ovariectomy，Ovx)和卵巢切除后补充雌激素组(ovariectomy+estrogen， Ovx+E)。

2试剂及仪器

Trizol试剂(TaKaRa),实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa),StepOne Real-time PCR仪(ABI)，紫外分光光度计(Eppendorf)，Biometra 96 PCR仪(Biometra)，17β-雌二醇(Sigma)，格列本脲(Sigma)，iWorx 214电生理记录仪(iWorx)，重酒石酸去甲肾上腺素(武汉远大制药公司)，麻油(Sigma)。

3方法

3.1动物模型的建立 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，取侧卧位固定，以最后肋骨稍后方为中心备皮、消毒。自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口约1～2 cm，切开皮肤，离脊柱约1 cm并沿肩胛线分别于左右两肋下剪开腰肌，切口长约1 cm，立即见位于两侧肾脏外下方呈淡粉红色的卵巢及紧密相连的子宫角，轻轻夹住脂肪组织将其拉出体外。在子宫角上部及下部的输卵管部位做2个结扎，结扎后剪断子宫角，将卵巢摘除。把脂肪组织推回腹腔内，将腹膜与肌层一起缝1针，检查有无出血，缝合皮肤。术后常规腹腔注射抗生素3 d，并连续阴道涂片，Ovx组及Ovx+E组阴道上皮无动情周期变化提示去势完全。

3.2药物干预 于去势后第4周Ovx+E组每天皮下注射100 μL溶有17β-雌二醇(10 μg/kg)的麻油，Ovx组及sham组每天皮下注射等体积麻油，连续给药2周后，每组各取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉后处死，提取肠系膜动脉组织。

3.3子宫指数的测定及HE染色 所有大鼠处死前称取体重，处死后剪取子宫，电子分析天平称取子宫湿重，计算子宫指数(子宫湿重/大鼠体重)。然后进行冰冻切片，行HE染色。

3.4Real-time RT-PCR 检测KATP通道mRNA的表达 用Trizol试剂盒提取各组大鼠肠系膜动脉RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，按实时定量RT-PCR试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA，然后在ABI StepOne Real-time PCR仪上进行PCR反应。PCR引物序列见表1，其反应条件为：95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。分析熔解曲线，根据熔解曲线判断是否存在非特异性扩增。以2-ΔΔCt的方法分析 mRNA的相对表达变化，ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(内参照基因)]处理组-[Ct(目的基因)-Ct(内参照基因)]对照组[3-4]。

表1 Real time PCR引物序列

3.5血管反应性 通过给予NE后平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)的变化观察动脉血管的反应性[5]。大鼠吸入异氟烷麻醉后，通过颈总动脉插管连接压力换能器监测动脉血压，通过颈静脉插管开放静脉通道。手术完成后，平衡血压30 min，通过静脉插管推注NE 3 μg/kg，记录注射NE 前后大鼠MAP值，NE作用后MAP变化值反映整体血管反应性。格列本脲溶于0.01 mol/L NaOH溶液中，静脉插管缓慢注射4 g/L格列本脲(1 mg/kg)，5 min后重复上述实验，给予3 μg/kg NE[6]。

4统计学处理

结 果

1子宫HE染色

Sham组和Ovx+E组大鼠的子宫外观质地饱满、色泽粉红，而Ovx组大鼠子宫质地细薄、色泽较白。与sham组相比较，Ovx+E组大鼠子宫指数差异无统计学意义(P>0.05)，而Ovx组大鼠子宫指数显著降低(P<0.05)，见表2。HE染色可以看出Ovx组大鼠子宫肌层及内膜萎缩，体积明显减小，腺体减少散在、腔隙变窄，sham组及Ovx+E组子宫内膜及肌层明显增厚，腺体数量增加、腔隙增大，见图1。

2肠系膜动脉中KATP通道mRNA的表达

与sham组相比，Ovx 组大鼠肠系膜动脉KATP通道的Kir6.1亚单位mRNA表达减少(P<0.05)，而Ovx+E组SUR2B亚单位mRNA表达增加(P<0.05)。与Ovx组比较，Ovx+E组Kir6.1和SUR2B亚单位mRNA表达增加(P<0.05)，见图2。

表23组子宫指数的比较

GroupUterineindexSham1.947±0.270Ovx0.285±0.040*Ovx+E1.684±0.600#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsOvx group.

Figure 1. Histological changes of the rat uteri in different groups (HE staining). A，B，C:×40；D，E，F:×100.

图1各组大鼠子宫的组织学变化

图2大鼠肠系膜动脉KATP通道亚单位Kir6.1和SUR2BmRNA的表达

3血管反应性

与sham组相比，Ovx组大鼠在NE作用下的MAP增幅明显升高(P<0.05)，而Ovx+E组无明显变化。与Ovx组相比，Ovx+E组NE引起的MAP增幅显著降低(P<0.05)。给予KATP通道阻滞剂格列本脲后，sham组和Ovx+E组对NE的反应性增加(P<0.05)，此时3组之间NE引起的MAP增幅无明显差别(P>0.05)，见图3。

图3NE诱导的升压反应

讨 论

本研究结果显示，雌激素可以增加肠系膜动脉血管平滑肌细胞KATP通道mRNA的表达；卵巢去势后大鼠对NE的升压作用反应性增加，补充雌激素后则可以抑制此作用。

本实验首先通过阴道涂片观察大鼠的动情周期，判断卵巢去势模型的建立是否成功。在确定卵巢去势成功后，再分别补充雌激素。补充雌激素后的大鼠子宫指数与假手术组相比无明显差异，但比去势组明显升高，同时HE染色可以看到Ovx组大鼠子宫肌层及内膜萎缩，体积明显减小，腺体减少散在、腔隙变窄，sham组及Ovx+E组子宫内膜及肌层明显增厚，腺体数量增加、腔隙增大，这说明卵巢去势模型建立成功及雌激素干预有效。

如前所述，冠心病及卒中主要是由高血压和动脉硬化等可以导致血管功能受损的一类疾病所引起，而这种血管功能损害主要表现为血管收缩功能增强、舒张功能减弱。因此，本实验选择静脉注射NE引起的升压效应来反映动脉血管的收缩功能。结果显示，卵巢去势后大鼠对NE升压效应的反应性明显增加，血管反应性增加；而卵巢去势后又重新补充雌激素，大鼠血管反应性与假手术组大鼠相比则没有明显差异。由此可以说明，卵巢去势后导致雌激素缺乏，使得血管收缩功能增强，反应性增高，补充雌激素可以降低血管对NE的反应性。流行病学研究显示，绝经后的女性高血压的发病率明显高于绝经前女性。其它研究也提示，雌激素可以通过调控血管活性物质如前列环素、一氧化氮、血浆内皮素的生成与分泌，抑制血管的收缩，从而使血管扩张[7-8]。

KATP通道是一种内向整流性钾通道，其开放主要受细胞内ATP水平的调控，在ATP浓度降低或缺氧时其开放率明显增加，从而将各种兴奋性组织中细胞的电活动与胞质的代谢状态相偶联[9]。KATP通道在广泛分布与心肌细胞、胰岛β细胞、骨骼肌细胞、血管与非血管平滑肌细胞和神经细胞等多种细胞中。血管平滑肌细胞KATP通道由Kir6.1和SUR2B亚单位构成，此通道开放，K+外流增加，细胞超级化，接着引起电压门控Ca2+通道关闭增加并降低Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度的降低引起血管平滑肌细胞收缩功能的降低和反应性降低[10]。可见KATP通道对动脉平滑肌细胞的膜电位和动脉血管张力起重要的调节作用[2, 11]。它广泛参与了多种血管活性药物对血管功能的调节如腺苷、β受体激动剂，以及休克时血管功能变化[12]。在内毒素性休克时，血管反应性明显降低，而在给予一定量的KATP通道的阻滞剂格列本脲后，可以增强血管对NE的反应性。Shi等[13]的研究发现脂多糖可以增加血管平滑肌KATP通道的表达，这进一步说明了KATP通道对血管反应性起着重要的作用。我们推测KATP通道可能参与了雌激素降低血管对NE反应性的过程。

本研究采用实时荧光定量PCR检测雌激素是否影响了肠系膜动脉血管平滑肌细胞KATP通道表达。肠系膜动脉床面积大，在维持外周阻力中具有重要作用，因此本实验取材于肠系膜动脉。而实验结果显示卵巢去势组大鼠肠系膜动脉组织中KATP通道各亚单位mRNA表达较假手术组明显降低，而补充雌激素后KATP通道表达又明显升高。这说明雌激素可以上调肠系膜血管平滑肌KATP通道的表达。其它研究也发现类似雌激素上调KATP通道的现象：Huang等[14]研究发现，雌激素作用于下丘脑POA区通过上调KATP通道来发挥对GnRH释放峰的负反馈作用。Ranki等[15]研究结果显示，雌激素可以上调心脏组织KATP通道表达，从而增加心肌细胞对代谢应激的耐受力。Park等[16]发现暴露在雌激素下的子宫平滑肌KATP通道的表达增加，可能导致子宫平滑肌瘤细胞的增殖。同时，我们实验结果显示，给予KATP通道阻滞剂格列本脲后，NE引起的升压作用在sham组、Ovx组及Ovx+E组之间无明显差别。这进一步证实了KATP通道可能参与雌激素减低血管对NE的反应性。

总之，本研究表明雌激素可能通过上调肠系膜动脉平滑肌细胞KATP通道的表达来降低血管对缩血管物质刺激的反应性。这可能是雌激素对心血管保护作用的另一种潜在机制，也可能是绝经后女性冠心病及卒中发生率发病率迅速增高的原因之一。

[1] Appelros P, Stegmayr B, Terent A. Sex differences in stroke epidemiology: a systematic review [J]. Stroke, 2009, 40(4): 1082-1090.

[2] Wang X, Wu J, Li L, et al. Hypercapnic acidosis activates KATPchannels in vascular smooth muscles [J]. Circ Res, 2003, 92(11): 1225-1232.

[3] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod [J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108.

[4] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[5] 李 涛，徐 竞，刘良明，等. 缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2011, 27(03): 437-442.

[6] Nakagawa M, Hori S, Adachi T, et al. Adenosine triphosphate-sensitive potassium channels prevent extension of myocardial ischemia to subepicardium during hemorrhagic shock[J]. Shock, 2008, 30(2): 178-183.

[7] Ross RL, Serock MR, Khalil RA. Experimental benefits of sex hormones on vascular function and the outcome of hormone therapy in cardiovascular disease[J]. Curr Cardiol Rev, 2008, 4(4): 309-322.

[8] Pojoga LH, Yao TM, Sinha S, et al. Effect of dietary sodium on vasoconstriction and eNOS-mediated vascular relaxation in caveolin-1-deficient mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 294(3): H1258-H1265.

[9] Nichols CG. KATPchannels as molecular sensors of cellular metabolism [J]. Nature, 2006, 440(7083): 470-476.

[10]Buckley JF, Singer M, Clapp LH. Role of KATPchannels in sepsis [J]. Cardiovasc Res, 2006, 72(2): 220-230.

[11]Brayden JE. Functional roles of KATPchannels in vascular smooth muscle [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002, 29(4): 312-316.

[12]Collin S, Sennoun N, Dron A G, et al. Vascular ATP-sensitive potassium channels are over-expressed and partially regulated by nitric oxide in experimental septic shock[J]. Intensive Care Med, 2011, 37(5): 861-869.

[13]Shi W, Cui N, Wu Z, et al. Lipopolysaccharides up-regulate Kir6.1/SUR2B channel expression and enhance vascular KATPchannel activity via NF-κB-dependent signaling[J]. J Biol Chem, 2010, 285(5): 3021-3029.

[14]Huang W, Acosta-Martinez M, Levine JE. Ovarian steroids stimulate adenosine triphosphate-sensitive potassium KATPchannel subunit gene expression and confer responsiveness of the gonadotropin-releasing hormone pulse generator to KATPchannel modulation[J]. Endocrinology, 2008, 149(5): 2423-2432.

[15]Ranki HJ, Budas GR, Crawford RM, et al. 17β-estradiol regulates expression of KATPchannels in heart-derived H9c2 cells[J]. J Am Coll Cardiol, 2002, 40(2): 367-374.

[16]Park SH, Ramachandran S, Kwon SH, et al. Upregulation of ATP-sensitive potassium channels for estrogen-mediated cell proliferation in human uterine leiomyoma cells[J]. Gynecol Endocrinol, 2008, 24(5): 250-256.

EstrogenaffectsreactivityofratmesentericarterythroughATP-sensitivepotassiumchannel

ZHANG Deng-wen, XU Lin, ZHANG Chuan-han, HAN Ai-di, YAO Wen-long, WANG Xue-ren

(DepartmentofAnesthesiology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:xrwang@mail.hust.edu.cn)

AIM: To observe the expression of ATP-sensitive potassium (KATP) channel mRNA in mesenteric artery smooth muscle of rats with estrogen administration, and to evaluate the role of KATPchannel in the effects of estrogen on the reactivity of mesenteric artery in rats.METHODSForty-eight female Sprague-Dawley rats, weighing (100±10) g, were randomly divided into 3 groups: sham operation (sham) group, ovariectomy (Ovx) group and ovariectomy with estrogen administration (Ovx+E) group. The mRNA expression of KATPsubunits in mesenteric artery smooth muscle was detected by quantitative real-time PCR. Artery reactivity in the rats was observed by norepinephrine-induced pressor response.RESULTSCompared with sham group, the mRNA expression of Kir6.1 and SUR2B was significantly decreased in Ovx group (P<0.05), but increased in Ovx+E group (P<0.05). Compared with sham group and Ovx+E group, the pressor response induced by norepinephrine in the rats were enhanced in Ovx group (P<0.05). No significant difference between sham group and Ovx+E group was observed. After administered with glibenclamide (a KATPchannel blocker), the pressor response induced by norepinephrine was enhanced in sham group and Ovx +E group, and no changes in Ovx group. Meanwhile, no difference among the 3 groups was found.CONCLUSIONEstrogen up-regulates the expression of KATPchannel subunits, which may be involved in estrogen-reduced pressor response to norepinephrine.

Estrogen; ATP-sensitive potassium channels; Vascular reactivity; Norepinephrine

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.005