14-3-3γ对烧伤及LPS诱导所致大鼠心肌损伤的保护作用*

刘 丹， 尹 东， 严广华， 孙 惦， 许 旻， 何 明△

(南昌大学 1医学院，2第二附属医院江西省分子医学重点实验室，江西 南昌330006)

1000-4718(2012)07-1160-06

2012-02-16

2012-05-03

国家自然科学基金资助项目(No.30460048;No.81072632;No.81160402;No.81100104)；博士后基金资助项目(No.20110491496)

△通讯作者 Tel: 0791-86362231；E-mail: jxhm56@163.com

▲并列第1作者

14-3-3γ对烧伤及LPS诱导所致大鼠心肌损伤的保护作用*

刘 丹1▲， 尹 东2▲， 严广华1， 孙 惦1， 许 旻1， 何 明1△

(南昌大学1医学院，2第二附属医院江西省分子医学重点实验室，江西 南昌330006)

目的研究14-3-3γ在烧伤及脂多糖(LPS)引起的心肌损伤中的保护作用。方法体内实验建立大鼠烧伤及LPS损伤模型，检测3、6、12、24 h各时点心功能及心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平的改变；体外实验采用新生大鼠心肌细胞，构建pFLAG-14-3-3γ质粒，于LPS损伤前24 h转染至心肌细胞，实验结束后检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH) 活性，MTT法测定细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡，线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果烧伤及LPS损伤模型大鼠心电图ST段均有明显改变，心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平均显著升高。转染了pFLAG-14-3-3γ质粒的心肌细胞能明显对抗随后的LPS损伤，与未转染组比较，14-3-3γ能明显提高细胞存活率，降低LDH活性，减少细胞凋亡，抑制mPTP的开放。结论14-3-3γ可能通过抑制mPTP的开放对烧伤及LPS所致的心肌损伤起保护作用。

14-3-3γ蛋白； 脂多糖类； 烧伤； 心肌； 线粒体通透性转换孔

大量研究证明，严重烧伤可引起心肌器质性损害[1]。而烧伤后的内毒素血症是造成心肌损害的主要因素[2]。所以，研究内毒素所致心肌损伤的机制，对于预防严重烧伤患者因心力衰竭所致死亡有重要意义。14-3-3蛋白家族主要有7种亚型，是存在于几乎所有生物体细胞中的一类重要蛋白质，在机体许多疾病的发生、发展中发挥重大作用[3]。有研究表明[4]，14-3-3γ亚型在大鼠主动脉受损心肌组织中表达明显升高，提示其有可能在提高心肌组织对损伤的反应性以及作为修复信号等方面发挥重要作用。据此，本研究拟构建大鼠严重烧伤模型、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)整体大鼠心脏损伤模型及大鼠乳鼠原代培养心肌细胞LPS损伤模型，从整体动物与细胞水平不同层次上，对14-3-3γ在内毒素所致心肌损伤中的作用及机制进行探讨。

材 料 和 方 法

1药品与主要试剂

pFLAG-CMVTM-4 质粒(Sigma)；限制性内切酶EcoR I和KpnI(NEB)；逆转录试剂盒、T4 DNA 连接酶、凝胶回收试剂盒及无内毒素质粒提取试剂盒购自Promega；14-3-3γ抗体、β-actin 抗体及相应Ⅱ抗(Santa Cruz)；线粒体分离试剂盒(Biovision)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；MEM培养基(Gibco-BRL)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；增强化学发光印迹试剂和硝酸纤维素膜(Amersham)、胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、 TEMED、 EDTA 和 DTT均购自Sigma；其它试剂均为分析纯。

2方法

2.1体内实验部分

2.1.1动物及分组 成年健康Wistar大鼠80只，体重(220±20)g，随机分为2组：I组(烧伤组)，除正常对照外，其余动物脱毛后用烫伤仪制成30%体表面积III度烫伤模型；Ⅱ组(LPS处理组)，除正常对照外，其余大鼠尾静脉注射LPS 1 mg/kg。处理后在相应时点(3、6、12、24 h)作相应检测。

2.1.2大鼠心脏功能检测 (1)记录大鼠标准Ⅱ导联心电图，计算ST段改变(上升或下降)的频率与数量；(2)摘眼球取血2～3 mL，室温静置1 h，2 000 r/min离心，取血清；用Beckman全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase,CPK)、肌酸磷酸激酶同工酶(CPK-MB)等心肌酶谱之活性。

2.1.3Western blotting检测 实验结束后，加入三去污剂裂解液裂解心肌细胞，提取总蛋白，同等量蛋白质完成SDS-PAGE后，进行电转膜，再先后结合Ⅰ抗和Ⅱ抗，最后X线胶片曝光分析。

2.2体外实验部分

2.2.1心肌细胞的分离培养 下列操作均在超净台内进行[5]。取出生1～3 d的SD乳鼠，开胸取出心脏，分离心室组织，经0.1%胰酶消化分离，用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后置CO2培养箱(5%CO2、37 ℃)培养2 h去除成纤维细胞，计算细胞悬液中台盼蓝拒染的活细胞数，达90%以上。分别按5×105cells/well和1×105cells/well接种于6孔培养板和96孔培养板内，CO2培养箱培养，隔天换培养液，前3 d加入终浓度为0.1mmol·L-1Brdu抑制纤维细胞生长，培养4 d随机分组进行实验。

2.2.214-3-3γ真核表达载体pFLAG-14-3-3γ的构建 取大鼠心肌组织50 mg，用RT-PCR方法获取14-3-3γ(GenBank D17447.1)的全长编码cDAN，上游引物5'-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3'，下游引物5'-TTAGGTACCTGGGGCCTTAGTTGTT-3'，分别在上、下游引物中引入EcoR I和KpnI的酶切位点及保护性碱基。PCR扩增后的目的基因cDNA与质粒pFLAG- CMVTM-4用EcoR I和KpnI双酶切、T4连接酶连接。连接反应产物转化感受态细胞并用抗生素筛选。质粒提取后，行酶切鉴定和DNA测序。

2.2.3pFLAG-14-3-3γ重组质粒转染及表达效率的检测 在转染前，PBS洗2次，除去抗生素，将LipofectamineTM2000 (μL) 与DNA (μL) 以2.0∶ 0.8 的比例混合，加入到每孔细胞中去，置于培养箱(5% CO2、95%空气、37 ℃)中孵育。24 h 后，裂解细胞，提取蛋白，Western blotting检测心肌细胞14-3-3γ蛋白表达，以空载质粒载体pFLAG为对照。

2.2.4实验分组 (1)正常对照组；(2)LPS组：加LPS至培养液中，终浓度为10 mg/L，孵育6 h；(3)pFLAG+LPS组：空载质粒pFLAG转染至心肌细胞中，24 h后处理同LPS组；(4)pFLAG-14-3-3γ+LPS组：重组质粒pFLAG-14-3-3γ转染至心肌细胞中，24 h后处理同LPS组。

2.2.5细胞存活率检测 采用MTT比色法检测。胰酶消化后收集细胞，每组细胞以1×104cells/well浓度接种于96孔培养板中。细胞覆盖率达70%～80% 后吸出培养基。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1溶于PBS)20 μL，37 ℃孵育4 h。小心地吸弃孔内培养上清液，再每孔加DMSO 150 μL振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解。酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其吸光度(A)，以间接反映各组活细胞数量。

2.2.6生化检测 实验结束后各组分别取孵育液200 μL，Beckman生化自动分析仪测定LDH活性。

2.2.7细胞凋亡检测 各级处理结束后，收集细胞，在细胞悬液中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μL binding buffer，立即进行流式细胞术检测。

2.2.8线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放检测 按试剂盒说明分离心肌细胞线粒体，通过线粒体肿胀实验检测mPTP 的开放。520 nm波长测各组吸光度初值(A1)，加200 μmol·L-1CaCl2诱导mPTP 开放，20 min 后吸光度不再变化，记录此时吸光度值(A2)，ΔA=A1-A2。用ΔA/min×103表示mPTP 开放程度。

3统计学处理

结 果

1体内实验部分

1.1烧伤及LPS处理后各时点心电图改变 如表1所示，烧伤组(Ⅰ)及LPS组(Ⅱ)大鼠心电图ST段改变随致伤时间的延长而愈加明显，其中烧伤组从12 h开始 ST段改变明显(P<0.05)，LPS组从6 h开始ST段改变明显(P<0.05)。

表1烧伤及LPS处理对大鼠心电图ST段改变的影响

GroupIncidenceNSTBurnLPSBurnLPSControl----3h17.5±3.211.2±2.036±716±56h18.2±2.717.6±2.5*38±929±9*12h30.4±3.3*21.7±2.8*55±11*34±10**24h33.6±3.5*24.5±3.1**59±13*37±8**

*P<0.05,**P<0.01vs3 h. NST: non-stress test.

1.2烧伤及LPS处理后各时点生化指标改变 烧伤组(Ⅰ)及LPS组(Ⅱ)的LDH、CPK和CPK-MB在致伤后3 h均明显升高(P<0.01)，致伤后6 h基本达到峰值，并持续到24 h，见图1。

1.3烧伤及LPS处理后各时点14-3-3γ蛋白改变 烧伤后，心肌14-3-3γ蛋白表达在24 h才出现明显的升高(P<0.01)，而LPS处理后，心肌14-3-3γ蛋白表达在6 h即出现明显升高(P<0.01)，并持续至24 h，见图2。

图1烧伤及LPS处理后大鼠各时点血清LDH、CPK和CPK-MB活性的改变

2体外实验部分

2.1培养心肌细胞的一般特性 分离培养的心肌细胞在培养4～6 h后开始贴壁生长，伸出伪足，形态由圆形变为梭形、三角形或星形；24 h后细胞基本贴壁，少数单个细胞呈现不同频率的自发性搏动(60～80 min-1)；72 h后细胞伸出伪足相互交织成网状，逐渐形成细胞簇，搏动成同步性，收缩有力(90～110 min-1)。

2.2转染pFLAG-14-3-3γ至心肌细胞的蛋白表达 Western blotting结果显示，转染了空载质粒pFLAG 组14-3-3γ蛋白表达与正常组相比无改变，而转染了重组质粒的pFLAG-14-3-3γ组，14-3-3γ蛋白表达则明显增加(P<0.01)。此结果说明重组的14-3-3γ真核表达载体在原代乳鼠心肌细胞中能有效表达，见图3。

图2Westernblotting检测烧伤及LPS处理后各时点心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平的变化

图3Westernblotting检测转染pFLAG-14-3-3γ至心肌细胞后14-3-3γ蛋白的表达

2.314-3-3γ基因转染对LPS损伤后细胞存活率、LDH的影响 LPS组与对照组比较细胞存活率明显降低，LDH活性升高(P<0.01)； 而转染了pFLAG-14-3-3γ的心肌细胞，则能明显对抗随后LPS所致损伤，使细胞存活率明显升高、LDH降低(P<0.01)，见表2。

表214-3-3γ基因转染对LPS损伤后细胞存活率和LDH释放的影响

GroupViability(%)LDH(U·L-1)Control94.5±7.33.22±0.49LPS27.8±4.3**34.26±5.31**pFLAG+LPS24.3±4.9**36.28±4.39**pFLAG-14-3-3γ+LPS67.5±6.2##15.63±2.41##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS.

2.414-3-3γ基因转染对LPS损伤后细胞凋亡的影响 LPS处理使细胞凋亡达到(32.5±4.2)%，与对照组相比明显升高(P<0.01)，而转染了pFLAG-14-3-3γ的细胞再遭受LPS损伤处理，则细胞凋亡降至(17.3±2.1)%(P<0.01)，见图4。

2.514-3-3γ基因转染对LPS损伤后mPTP开放的影响 mPTP 开放时，线粒体通透性增大，导致线粒体肿胀，吸光度下降。LPS组ΔA/min值较对照组明显升高(P<0.01)，提示LPS处理能使mPTP开放，线粒体通透性增加。转染pFLAG-14-3-3γ能明显阻止LPS所致的mPTP开放，使ΔA/min值明显下降(P<0.01),见图5。

图4转染14-3-3γ基因对LPS损伤后心肌细胞凋亡的影响

图5转染14-3-3γ基因对LPS损伤后mPTP开放的影响

讨 论

众所周知，机体遭受严重烧伤后，肠道细菌移位以及创面外源性感染，大量细菌毒素入血，导致休克，甚至多器官功能衰竭，而心脏则是主要毒性靶位之一[6]。我们在体外实验中建立大鼠烧伤模型及LPS损伤模型，结果显示在致伤后3～24 h均有不同程度ST段改变，且随着致伤时间的延长而更为明显； LDH、CPK、CPK-MB等心肌酶谱在致伤后3 h即明显升高，致伤后6 h基本达到峰值，并持续到24 h。这一结果表明，烧伤组及LPS组大鼠心脏确实均存在着严重急性损伤。寻找内源性保护性蛋白是本研究的重点。

14-3-3蛋白是一个细胞内磷酸化结合调节分子，其通过与许多信号蛋白结合，调节几乎所有重要的信号转导、凋亡、细胞周期通道[7-8]。近年来大量研究证实14-3-3蛋白在许多疾病的发生与发展过程中，可能发挥十分重要的作用。有研究指出，球囊扩张术后，大鼠颈动脉平滑肌细胞与心肌细胞内14-3-3γ亚型蛋白表达上调[4]；原代培养的胶质细胞急性缺氧/复氧损伤也使得14-3-3γ亚型蛋白表达增加[9]，这些研究结果均说明14-3-3γ可能在急性损伤时，对于提高组织对损伤的反应性以及作为修复信号等方面发挥重要作用。为此，我们在体外实验中检测14-3-3γ蛋白表达水平的改变，结果表明，在烧伤及LPS处理后，随着时间的延长14-3-3γ表达开始升高，提示14-3-3γ作为一个内源性蛋白的表达升高，可能参与了机体对抗烧伤所致内毒素血症对心肌的急性损伤。

为了进一步研究14-3-3γ在心肌遭受内毒素急性损伤过程中所起的作用，我们构建了pFLAG-14-3-3γ重组质粒，将其转染至原代培养的乳鼠心肌细胞中，结果表明转染了pFLAG-14-3-3γ的心肌细胞，对随后的LPS急性损伤能起到明显的对抗作用，并且这种对抗作用是通过减少mPTP的开放来完成的。mPTP是线粒体跨膜多蛋白复合物孔，在某些因素的刺激下，mPTP开放，当其长时间开放，会导致线粒体外膜的破裂，分布在膜间的前凋亡分子释放，包括细胞色素C、第2种源自线粒体的胱冬酶激活蛋白/具有低等电点的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)结合蛋白(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI, Smac/Diab-LO)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)、核酸内切酶G(Endo G)和Htra2/Omi。这些分子通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases，细胞内与凋亡有关的蛋白酶)依赖机制和非caspase依赖(例如AIF)机制导致细胞死亡[10-11]。那么，14-3-3γ是通过何种机制抑制mPTP的开放，从而对急性的心肌细胞产生保护作用，将是我们进一步研究的重点。

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Protectiveroleof14-3-3γinburnandLPS-inducedratmyocardialinjury

LIU Dan1, YIN Dong2, YAN Guang-hua1, SUN Dian1, XU Min1, HE Ming1

(1MedicalCollege,2JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,theSecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:jxhm56@163.com)

AIM: To study the protective role of 14-3-3γ in burn or LPS-induced myocardial injury.METHODSThe rat model of burn or LPS-induced injury was established. The heart functions and 14-3-3γ protein expression were detected 3 h, 6 h, 12 h and 24 h after treatment. Primary neonatal rat cardiomyocytes were usedinvitro. pFLAG-14-3-3γ plasmid was constructed and transfected into the cardiomyocytes 24 h before LPS-induced injury. The injury in the cardiomyocytes was evaluated by measuring the cell viability and the level of lactate dehydrogenase(LDH). Apoptosis of cardiomyocytes was detected by flow cytometry. Opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) was also determined by Ca2+-induced swelling of isolated myocardial mitochondria.RESULTSThe expression of 14-3-3γ was elevated following the burn or LPS-induced myocardial injuryinvivo.Invitro, transfection with pFLAG-14-3-3γ plasmid in to the cardiomyocytes significantly protected against LPS-induced injury. Compared with the cardiomyocytes without transfection with pFLAG-14-3-3γ plasmid, higher cell viability rate and lower LDH release, cell apoptosis and mPTP opening were observed in the cardiomyocytes transfected with pFLAG-14-3-3γ plasmid.CONCLUSIONThe 14-3-3γ protein protects the heart against burn or LPS-induced injury by inhibiting the mPTP opening.

14-3-3γ protein; Lipopolysaccharides; Burns; Myocardium; Mitochondrial permeability transition pore

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.002