暖宫孕子胶囊对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

孟慧玲，粱 真，于迎新，韩凤梅，张清秀，李聪华

(河北省沧州市妇幼保健院，河北 沧州 061000)

鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrahe，CAM)是研究血管形成与抗血管形成的理想体内模型，以鸡胚绒毛尿囊膜为体内模型研究血管新生药物已成为热点[1]。暖宫孕子胶囊具有滋阴养血、温经散寒、行气止痛作用，是一种纯中药制剂，用于血虚气滞、腰酸疼痛、经水不调、赤白带下、子宫寒冷、久不受孕等症。研究证实暖宫孕子胶囊有改善克罗米芬促排卵患者雌激素抵抗的作用。为进一步探讨其机制，笔者就暖宫孕子胶囊对CAM血管生成的影响进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

MCO-5AC型二氧化碳细胞培养箱(日本三洋电器集团);超净工作台;倒置显微镜;眼科剪;眼科镊;注射器;微量移液器及吸头等。暖宫孕子胶囊(威特药业有限公司，国药准字Z20090224);鸡胚(姚官屯种鸡场提供);混合纤维素酯微孔滤膜(上海新亚净化器材厂);氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司，批号为H13022576);乙醇(德州亿申康消毒制品有限公司，批号为20030297);丙酮(天津市医药工业技术研究所，批号为860912);甲醇(天津市化学试剂二厂，批号为050310);新吉尔灭(山东瑞泰奇洗涤消毒科技有限公司，批号为20050149)。

1.2 试验操作

暖宫孕子胶囊制备成相当于1 g/mL的药液，装入输液瓶中，100℃热水浴中处理30 min灭菌备用。将40枚鸡胚随机分为空白组和试验组，每组20枚。温水冲洗干净，1‰新吉尔灭纱布擦洗两遍消毒，放入二氧化碳培养箱中，培养温度(37.8±0.3)℃，培养箱中放入水盘以保持湿度在40～70%，留通气孔。每天转蛋4次，有利于胚胎发育均匀，同时每日检查胚胎发育情况，随时淘汰死弱精蛋和死胚及发育不良的种蛋。第7天，置超净工作台上，用牙科砂轮在气室上方蛋壳处磨切蛋壳，用眼科镊开1 cm×2 cm窗口，暴露下方的气室膜，用注射器针头在内膜上轻轻划破一小孔，勿伤及下面的CAM，用眼科镊剥去气室膜，将预先剪成直径5 mm并灭菌的混合纤维素酯微孔滤膜放在CAM两条卵黄静脉之间相对无血管处，试验组加入10μL暖宫孕子胶囊液，空白组加入10μL氯化钠注射液。然后用灭菌的透明胶纸封闭假气室，并将鸡胚做好分组标记，连续加药3 d。

3 d后，加入甲醇 -丙酮(1∶1)的固定液，预固定15 min，待CAM的血管完全凝固后.用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳和卵壳膜，并用眼科剪以滤纸载体为中心，完整剪下CAM，置盛有蒸馏水的平皿中，用眼科镊舒展CAM，将载波片置人蒸馏水的平皿，将舒展的CAM平铺其上，阴干保存。

血管计数，记录以载体为中心，半径1 mm内为一级血管，半径5 mm内为二级血管，记录一二级血管数目。

1.3 统计学处理

以SPSS13.0统计软件进行分析，鸡胚存活率进行 χ2检验;新生血管数以均数±标准差(X±s)表示。

2 结果

结果见表1和表2。

表1 CAM模型试验成活率

表2 两组对CAM模型血管生成的影响

3 讨论

王蕾等[2]研究发现，服用补肾生血药如山茱萸、熟地、枸杞子、龟板胶、当归等后的小鼠血清，可促进CAM的血管生成。张树成等[3]在对补肾调经方药作用机制的研究中发现，老年生理性肾虚的雌性金黄地鼠服用中药后，子宫组织中血管数目显著增加，树枝状分支广泛，可见明确的血管出芽生长，提示中药具有促进血管生成的作用。

CAM模型常用于血管新生促进或抑制的研究，具有周期短、成本低、易于大样本重复等特点，且观察结果客观可靠，是目前研究血管新生常用的活体模型之一 。有报道称直接加药于鸡胚CAM上，发现异物刺激过大、鸡胚成活率降低，但本试验没有发生此现象，试验中鸡胚发育正常，且CAM血管生长良好。本研究结果显示，试验组一级血管和二级血管总数量均较空白组多，证明暖宫孕子胶囊具有促进血管生成的作用。

暖宫孕子胶囊由熟地黄、香附、当归、川芎、白芍等药物组成，以滋阴养血药物为主。中医理论中活血化瘀、益气养血、补肾调经、填经生血、止血生肌、行气通脉等理论为中药促进血管生成的研究提供了依据。妊娠从着床到胎盘形成都离不开丰富的血液供应，离不开血管新生、通透性改变。哺乳动物胚胎植入的过程都伴有丰富的血管生成[4]。本研究显示暖宫孕子胶囊对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成有促进作用，可以推断暖宫孕子胶囊可能是通过促进血管生成而改善促排卵过程中的子宫内膜厚度，进而改善克罗米芬促排卵导致的高排卵率、低妊娠率。这为克罗米芬联合暖宫孕子胶囊促排卵提供进一步的科学依据，但暖宫孕子胶囊促进CAM血管生成的机制有待进一步的研究。

[1]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社，2001:2.

[2]王 蕾，张树成，吴志奎，等.鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型在中药研究中应用方法探讨[J].中药药理与临床，2000，16(6):46-47.

[3]张树成，吴志奎，王 蕾，等.补肾生血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究[J].中医杂志，2000，41(6):369.

[4]Ong S，Lash G，Baker PN.Angiogenesis and placental growth in normal and compromised pregnancies[J].Baillieres Best Pzact Res Clin Obstet Gynaceol，2000，14(6):969-980.