参附注射液对大鼠移植肝脏缺血-再灌注损伤的保护作用

陈 波，赖 星

(1.重庆市第九人民医院普外二科，重庆 400700;2.四川省宜宾市第三人民医院普外一科，四川 宜宾 466000)

肝脏缺血-再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)是导致肝移植后供肝功能低下甚至原发性无功能的主要原因之一[1]。在原位肝移植过程中，供肝缺血、门静脉阻断和血流再灌注不可避免。参附注射液的基本药理作用为增加冠状动脉血流及血管灌注量、延长动物耐缺氧时间、保护缺血心肌等[2-3]。因此，本试验通过建立大鼠原位肝移植模型，观察参附注射液对移植肝脏的保护作用及其机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选取健康雄性SD大鼠，体重240～280 g，10～12周龄，购自重庆医科大学实验动物中心，合格证号为SCXK渝20020003。酶联免疫吸附(ELISA)测定试剂盒(Active motif公司);参附注射液(四川雅安三九药业有限公司，国药准字Z51020664)。Beckman CX7型全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原位肝移植模型的建立与分组

将SD大鼠分为参附组、对照组和模型组(n=20)。参附组供肝在获取前经腰静脉灌注参附注射液(2 mL/100 g)、对照组注入等量生理盐水，模型组不予处理。切取供肝置于0～4℃ UW保存液内，参照两袖套法建立同种异体肝移植模型[4];在门静脉再灌注0，60，180 min后分别处死8只大鼠，抽取下腔静脉血液5 mL，并切取肝左外叶组织备检。

1.2.2 肝脏组织的病理学观察

取左肝前叶肝组织，放入10%中性甲醛溶液中固定24～48 h，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片(片厚5μm)，HE染色，于光学显微镜下观察。

1.2.3 肝功能检测

抽腔静脉血5 mL，血样于4℃下以4 000 r/min转速离心，10 min，取上清液置于-70℃冰箱保存。使用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬酸氨基转移酶(AST)。根据ELISA试剂盒说明书测定再灌注0，60，180 min后血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS 17.0对资料进行独立样本 t检验，数据以X±s表示，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后一般情况和病理改变

对照组和模型组大鼠术后180 min内精神萎靡、皮毛粗糙、活动少、不进水、小便黄染;参附组大鼠术后精神较好，可少量活动，可进水。再灌注180 min后，对照组和模型组大量肝细胞坏死，肝小叶结构明显凌乱，出现空泡样变，血窦扩张，汇管区可见大量炎症细胞浸润;参附组仅少量肝细胞坏死，肝小叶结构轻度凌乱，肝血窦轻度淤血，少量炎症细胞浸润，病理损伤较对照组和模型组轻。

2.2 肝功能指标

结果见表1。可见3组ALT和AST水平在再灌注0 min后差异均无统计学意义(P＞0.05);3组ALT和AST水平在再灌注60 min后都明显升高，但参附组含量均明显低于对照组和模型组(P＜0.05);再灌注180min后，3组ALT和AST水平仍然继续升高，但参附组升高程度较低，且明显低于对照组和模型组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠再灌注后肝功能和TNF-α水平变化比较(X ±s，n=20)

2.3 血清TNF－α

结果见表1。再灌注0 min后，3组TNF-α含量差异无统计学意义(P＞0.05);再灌注60，180 min后，3组TNF-α含量不断升高，但参附组含量明显低于对照组和模型组组(P＜0.05)。

3 讨论

肝移植大鼠门静脉被阻断，促使TNF-α表达，进而诱导黏附因子产生、补体激活、触发中性粒细胞过氧化呼吸爆发等，是造成再灌注损伤的主要原因[5]。参附为中医回阳救逆参附汤的中药制剂，主要成分为人参皂苷和乌头碱。研究证实，其基本药理为增加冠状动脉血流及血管灌注量、保护心肌、延长动物耐缺氧时间等。此外，人参皂苷能维持脑细胞能量代谢、改善脑内血流、增加缺血侧脑内三磷酸腺苷含量，并能阻止细胞钙通道，防止钙超载，减轻脑内钙离子积聚，抑制或减轻细胞结构的破坏[6-7]。

本试验通过参附预处理供肝，建立大鼠肝移植缺血-再灌注模型，观察其对移植肝脏的保护作用。结果表明，术后0 min，参附并未发挥有效作用;术后60 min和180 min，参附组ALT和AST含量明显低于对照组和模型组，且肝组织病理学改变较轻。ELISA检测血清TNF-α结果表明，术后60 min和180 min，虽然TNF-α的表达量不断升高，但参附组明显低于对照组和模型组，表明参附的作用机制在于降低了TNF-α的表达。

TNF-α可通过诱导黏附因子产生、补体激活、触发中性粒细胞过氧化呼吸瀑布式反应等，是造成缺血-再灌注损害的关键细胞因子[8]。本试验证明，参附对缺血-再灌注肝脏有明显保护作用，为临床预防肝移植术后的肝功能不全、肝切除术后肝功能损害提供了一个新的研究方向。

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