Hedgehog通路蛋白在慢性胰腺炎大鼠中的表达

夏伟 王洛伟 高军 黄玲 李兆申

·论著·

Hedgehog通路蛋白在慢性胰腺炎大鼠中的表达

夏伟 王洛伟 高军 黄玲 李兆申

目的检测慢性胰腺炎(CP)组织中hedgehog信号通路相关蛋白Ptch、Smo和Gli 1的表达,探讨其意义。方法60只SD大鼠按数字表法随机分为CP组(50只)和对照组(10只)。经尾静脉注射二丁基二氯基锡(DBTC)溶液8 mg·ml-1·kg-1方法制备CP模型；对照组尾静脉注射100%乙醇和甘油配制成的有机溶剂1 ml/kg体重。6周后处死动物，取胰腺组织常规病理检查，Sirius red染色测定胶原含量，免疫组化和RT-PCR法检测Ptch、Smo、Gli 1蛋白及mRNA的表达。结果制模后6周34只大鼠发展为CP，制模成功率为73.9%(34/46)。CP大鼠胶原含量显著高于对照组，差异有统计学意义[(38.52±6.49)%比(7.37±2.28)%，P<0.05]；Ptch、Smo、Gli 1蛋白阳性表达率分别为73.5%、64.7%和52.9%；Ptch、Smo、Gli1 mRNA表达量分别为2.38±0.42、3.85±1.03、4.63±1.49，均显著高于对照组的蛋白无表达及mRNA的表达(0.23±0.16、0.14±0.05、0.57±0.12，P值均<0.05)。结论CP组大鼠胰腺组织Ptch、Smo、Gli11均呈高表达，表明hedgehog信号通路参与胰腺慢性炎症反应和纤维化进程。

慢性胰腺炎； Hedgehog信号通路； 免疫组织化学

慢性胰腺炎(CP)的特征性改变是胰腺持续性炎症反应引起形态学上不可逆的纤维化和胰管狭窄或扩张，导致胰腺内外分泌功能不全。其发病机制包括氧化应激、中毒-代谢、导管梗阻和坏死-纤维化等理论[1]。hedgehog信号通路调节人类胚胎发育过程，主要由膜受体Ptch、Smo和核转录因子Gli等组成。它在包括胰腺癌等许多恶性肿瘤中异常表达[2-3]，但在CP发生中的作用罕见报道。本研究检测CP大鼠胰腺组织中hedgehog信号通路成员的表达，探讨该通路在CP发生过程中的作用。

材料与方法

一、动物模型及分组

60只SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供,体重190～210 g,雌雄不限,按数字表法随机分成CP组(50)和对照组(10只)。参考文献[4]，采用尾静脉注射由80 mg二丁基二氯基锡(DBTC)(Sigma公司)、4 ml 100%乙醇和6 ml甘油配制成的DBTC溶液8 mg·ml-1·kg-1体重的方法制备CP模型；对照组尾静脉注射等容积乙醇甘油液。6周后处死大鼠，取胰腺组织，部分置液氮保存，部分置10%中性甲醛液固定。

二、胰腺组织病理检查及Sirius red 染色

取固定的胰腺组织，常规病理检查。另取切片行Sirius red(Sigma公司)染色，光镜下观察3个高倍视野，应用Motic Images Advanced3.2图像分析系统测定Sirius red阳性染色面积(%)[5]。

三、Ptch、Smo、Gli1蛋白检测

采用免疫组化SP法,按试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书操作。山羊抗鼠Ptch、Gli多抗购自Santacruz公司；兔抗鼠Smo多抗购自Abcam公司。用已知阳性的前列腺癌作为阳性对照,PBS代替一抗作阴性对照。由两名病理科医师盲法阅片。以胞膜、胞质或胞核出现黄色或棕褐色颗粒为阳性染色。每例切片选取5个高倍视野,计数1000个细胞，根据阳性细胞所占百分率及显色深浅采用半定量积分法分级[6]：无阳性细胞者0分,<25% 1分,25%～75% 2分,>75% 3分；不显色或显色不清为0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。两分相加,0～1分为阴性 ,2为以上为阳性。

四、Ptch、Smo、Gli1 mRNA检测

取冻存胰腺组织,用Trizol(Invitrogen公司)提取组织总mRNA，紫外分光光度计检测mRNA的纯度和含量。Ptch引物上游5′-TGGTCACACGAACAATGG-3′ ，下游5′-TGAACTGGGCAGCTATGA-AGTC-3′，扩增片段202 bp；Smo引物上游5′-AGTTACATCGCAGCCTTC-3′，下游5′-CACACTACTCCA-GCCATC-3′，扩增片段299 bp；Gli1引物上游5′-TGCTGACACTCTGGGATA-3′，下游5′-CAGGGCCATAGTTGGTT-3′，扩增长度132 bp；内参GAPDH引物上游5′-ATCACTGCCACTCAGAAGAC-3′，下游5′-GCATCAAAGGTGGAAGAAT-3′， 扩增片段211 bp。引物采用Primer Premier 5.0软件设计，由上海英骏生物技术公司合成。使用逆转录试剂盒(Fermentas公司)合成cDNA,实时荧光定量PCR法检测mRNA表达。采用三步法对Ptch、Smo、G1i 1、GAPDH同时行实时PCR扩增。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 20 s、60℃ 34 s、72℃ 25 s，40个循环。PCR扩增结束后,从55℃至95℃每隔10 s升0.5℃,并收集一次荧光信号获得熔解曲线。通过PCR仪自带软件获取△Ct值，目的基因mRNA相对表达量=2-△△Ct，△△Ct 值=△Ct值目的基因-△Ct值内参基因。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠CP模型的建立

对照组大鼠一般情况良好，未见胰腺大体和组织学改变。CP组大鼠体重下降，精神状况较差，毛发无光泽、易激惹，活动减少，行动缓慢，个别体重明显减轻。实验过程中，CP组死亡4只，制模成功率73.9%(34/46)。CP大鼠的胰腺充血、水肿，主胰管轻度至重度扩张，胰腺组织呈黄色、薄平，部分大鼠可见胆管重度扩张、肝脏肿大、胆汁淤积等改变；镜下见不同程度的腺泡坏死、萎缩，淋巴细胞、单核细胞浸润，小叶内或小叶周围纤维化形成，伴胰管扩张(图1上)。

二、胰腺组织胶原含量

对照组仅见血管壁胶原沉积，胶原含量为(7.37±2.28)%。CP组胰腺组织内胶原沉积在导管周围至小叶内和小叶周围(图1下)，胶原含量为(38.52±6.49)%，显著高于对照组(P=0.026) 。

三、胰腺组织Ptch、 Smo 、Gli1蛋白及mRNA表达

Ptch、Smo蛋白主要定位于胞质及胞膜，Gli1蛋白主要定位于胞质和胞核。10只正常大鼠胰腺组织中均未见Ptch、 Smo 、Gli1蛋白表达(图2)。34只CP大鼠的胰腺组织中，25只(73.5%)有Ptch蛋白表达；22只(64.7%)有Smo蛋白表达；18只(52.9%)有Gli1蛋白表达(图2)。

图1对照组(a)和CP组(b)胰腺组织病理改变(上，HE ×200)及胶原纤维沉着(下，Sirius red染色 ×200)

图2对照组(左)和CP组(右)胰腺组织Ptch(a)、Smo(b)、Gli1(c)蛋白的表达(免疫组化 ×200)

对照组大鼠胰腺组织Ptch、Smo、Gli1 mRNA均呈低表达，相对表达量分别为0.23±0.16、0.14±0.05、0.57±0.12；CP大鼠胰腺Ptch、Smo、Gli1mRNA均呈高表达，表达量分别为2.38±0.42、3.85±1.03、4.63±1.49，两者差异具有统计学意义(P=0.018、0.037、0.024) 。

讨 论

DBTC对胰腺腺泡细胞具有直接毒性，它最初引起急性胰腺炎，随着炎症持续存在，坏死的腺泡细胞释放炎症介质和细胞因子，激活胰腺星状细胞，合成大量细胞外基质，形成纤维化病变[7]。 该模型在病因、致病机制及病理等方面与临床上的CP有相似之处，且有较好的重复性和操作性。本实验采用DBTC注射获得较高的制模成功率，胰腺组织的病理学改变亦证实造模成功。

文献报道[8]，基底细胞癌、小细胞肺癌、大肠癌、肝癌、卵巢癌及胰腺癌等组织中均可观察到hedgehog信号通路的异常表达，表明hedgehog通路参与多种肿瘤的发生、发展。本研究结果显示，CP大鼠的胰腺组织中存在hedgehog信号通路的过度激活，表明该通路亦参与胰腺慢性炎症反应和纤维化进程，但具体机制有待于进一步探讨。

[1] Jaster R，Emmrich J. Crucial role of fibrogenesis in pancreatic diseases. Best Pract Res Clin Gastroenterol,2008,22:17-29.

[2] Chuang PT,McMahon AP.Vertebrate Hedgehog signaling modulated by induction of a Hedgehog-binding protein.Nature,1999，397：617-621.

[3] Ruizi Altaba A,Sánchez P，Dahmane N．Gli and hedgehog in cancer：tumours，embryos and stem cells．Nat Rev Cancer，2002，2：361-372．

[4] van Westerloo DJ,Florquin S,de Boer AM, et al. Therapeutic effects of troglitazone in experimental chronic pancreatitis in mice. Am J Pathol,2005,166:721-728.

[5] Merkord J, Hennighausen G. Acute pancreatitis and bile lesions in rat induced by dibutyltin dichloride. Exp Pathol,1989,36:59-62.

[6] Gongoll S, Peters G, Mengel M, et al. Prognostic significance of calcium binding protein S100A4 in colorectal cancer.Gastroenterology,2002, 123:1478-1484.

[7] Glawe C, Emmrich J, Sparmann G, et al.In vivo characterization of developing chronic pancreatitis in rats.Lab Invest,2005,85:193-204.

[8] Kalderon D. Transducing the hedgehog signal.Cell,2000,103:371-374.

Expressionofhedgehogsignalpathwayinratswithchronicpancreatitis

XIAWei,WANGLuo-wei,GAOJun,HUANGLing,LIZhao-shen.
DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433，China

LIZhao-shen,Email：lizhaoshench@gmail.com

ObjectiveTo explore the expression and significance of hedgehog signal molecules (Ptch, Smo and Gli1) in chronic pancreatitis tissues in rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into CP group (n=50) and control group (n=10). DBTC solvent (8 mg·ml-1·kg-1) was injected into the rat via tail vein in CP group. In control group, rats were treated only with the solvent at a dose of 1ml/kg body weight. All rats were sacrificed 6 weeks later to observe the pancreatic pathologic changes. Collagen accumulation in pancreatic sections was determined by staining for Sirius red. Expressions of Ptch, Smo, Gli1 mRNA and protein in pancreatic tissues were assessed by RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsThe rate of chronic pancreatitis development in rats in CP group within six weeks was 73.9%. Collagen content was markedly higher in CP group than that in control group [(38.52±6.49)%vs(7.37±2.28)%,P<0.05]. No Path, Smo, Gli1 protein expression was observed in normal pancreatic tissues in control group. The positive rate of Ptch, Smo, Gli 1 expression was 73.5%, 64.7% and 52.9% in CP group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The expressions of Ptch, Smo, Gli1 mRNA were 2.38±0.42, 3.85±1.03, 4.63±1.49 in CP group, which were significantly higher than those in control group (0.23±0.16, 0.14±0.05, 0.57±0.12,P<0.05).ConclusionsThe Ptch, Smo, Gli1 was highly expressed in pancreatic tissues in CP rats, suggests hedgehog messenger pathway may play an important role in the chronic inflammation and fibrosis of chronic pancreatitis.

Chronic pancreatitis； Hedgehog signal pathways； Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.011

国家自然科学基金(30700360)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email：lizhaoshench@gmail.com

2011-05-24)

(本文编辑：屠振兴)