无精症及严重少精症患者Y染色体微缺失及细胞遗传学研究

杨欢利 毛英姿 诸溢扬 陈辉波

全世界大约有15%的育龄夫妇不育，不育夫妇中大约有50%与各种因素导致的男性精子发生障碍有关，其中30%的男性精子发生障碍是由染色体异常和基因突变、缺失等遗传因素造成的［1］。人类基因组序列分析及大片段功能性遗传序列检测证实人类Y染色体上存在许多精子发生相关基因，这些基因缺失或突变是导致男性原发性不育的遗传病因［2］。大约有5% ～10%的少精子患者及15% ～20%的无精子患者存在遗传异常，其中包括Y染色体微缺失及以Klinefelter综合征为主的染色体异常［3］。近年来随着睾丸内精子获取术(TESE)及胞质内单精子注射技术(ICSI)应用到男性不育的治疗中，使一些无精症及严重少精症患者获得了生育的机会。然而由于这些技术越过了自然选择的过程，具有将父代的遗传缺陷垂直传递给后代的风险。因此，在ICSI前进行遗传检测显得尤为重要。本研究通过对无精症及严重少精症患者进行Y染色体微缺失及细胞遗传学研究，调查其遗传异常发生类型及分布频率，同时为ICSI辅助生殖患者提供治疗前的遗传咨询。

对象与方法

1．对象:选择2010年3月～2012年3月来浙江省台州医院生殖中心进行Y染色体微缺失及细胞遗传学检测的不育男性及婚检男性共211人，年龄19～40岁，中位年龄29岁。所有检测者禁欲2～7天后自慰法留取精液，精液分析参照WHO第5版《人类精液检查与处理实验室手册》［4］进行。根据精液分析结果将研究对象分为无精症及严重少精症组(＜5×106/ml)和精液正常对照组，其中无精症患者精液连续3次检查并离心检测均未发现精子;严重少精子症患者精液分析3次，浓度均＜5×106/ml，正常对象分析2次结果都正常。同时留取检测者外周血标本2ml，一部分血液样本提取DNA进行Y染色体微缺失检测，另一部分培养用于细胞遗传学分析。

2．试剂:DNA提取试剂盒购自亚能生物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Multiplex PCR Assay Kit购自大连宝生物公司，RPMI1640培养基为Sigma公司产品。

3．方法:(1)Y染色体微缺失检测:取EDTA抗凝的外周血100μl提取DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的质量。根据目的基因大小及其之间互作效应将15个STS分到4管多重PCR体系中，每管采用性别决定因子(SRY)作为内控条带，其中Ⅰ管为 SY254、SY143、SY242、SY255，Ⅱ管为 SY84、SY239、SY152，Ⅲ管为 SY86、SY127、SY145、SY124，Ⅳ管为SY134、SY82、SY128、SY133。反应总体积为 25μl，扩增条件为50℃ 10min;95℃ 15min;94℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 60s，35 个循环;72℃延伸10min。取10μl PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，用BIO－RAD凝胶成像系统检测PCR产物条带的分布，判断Y染色体是否有缺失及缺失的位点和类型。如果存在位点的缺失，则利用该位点的特异性引物以SRY为内参重复进行2次扩增，无扩增该位点的条带时即确定该位点缺失。(2)细胞遗传学检测:将外周血用RPMI1640培养基培养72h，在终止培养前3～4h加入秋水仙素，继续培养3～4h。将培养的细胞浊液离心，对分离的细胞进行低渗、固定、胰蛋白酶消化及吉姆萨染色，每个样本至少分析20个分裂相。

4．统计学方法:采用SPSS 11．0统计软件进行数据处理，组间缺失率差异比较采用卡方检验，以P＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

1．Y染色体微缺失及细胞遗传学异常的分布:在73例无精症及严重少精症患者中检测到7例Y染色体微缺失及7例染色体核型异常，138例精液正常对照组中均未检测到Y染色体微缺失及染色体核型异常。无精症及严重少精症组Y染色体微缺失率为9.6%(7/73)，染色体核型异常率为9．6%(7/73)，其中Y染色体微缺失涉及AZF的3个区域，AZFb缺失率为1．4%，AZFc缺失率为 8．2%，AZFd缺失率为9.6%，AZFa未见缺失，具体见表1。经χ2检验，无精症及严重少精症组与精液正常对照组相比Y染色体微缺失频率差异极显著(χ2=10．86，P ＜0．01)。

表1 无精症及严重少精症患者Y染色体微缺失类型的分布

细胞遗传学异常涉及到5种核型，具体见表2。经χ2检验，无精症及严重少精症组与精液正常对照组相比染色体核型异常差异极显著(χ2=10．86，P＜0．01)。

表2 无精症及严重少精症患者染色体核型类型分布

2．无精症及严重少精症患者Y染色体微缺失与染色体核型比较分析:见表3，Y染色体微缺失在正常和异常染色体核型中都有发生，其缺失后的表现为无精症或严重少精症;其中AZFb位点缺失者都表现为无精症，AZFc或AZFd位点缺失者表现为无精症或严重少精症。通过Y染色体微缺失检测不能准确判断染色体核型是否异常，而仅进行细胞遗传学的核型分析也不能判断Y染色体微缺失是否发生，所以，对这些患者应进行Y染色体微缺失和核型分析两项检测。此外，染色体核型异常者表现为无精症。

表3 无精症及严重少精症患者Y染色体微缺失与染色体核型比较分析

3．Y染色体微缺失的多重PCR电泳图:在所检测到的7例Y染色体微缺失患者中共有3种类型的缺失，其中5例是AZFc和AZFd联合缺失，1例为AZFb、AZFc和AZFd联合缺失，1例为AZFd位点单独缺失(图1～图3)。

讨 论

图3 D位点单独缺失电泳图

在导致男性不育的各种因素中遗传因素起着关键作用，其中最常见的是Klinefelter综合征为主的染色体核型异常及Y染色体长臂微缺失［1］。本研究发现的7例染色体核型异常都导致无精症，其中3例为Klinefelter综合征。Tiepolo等［5］首次发现了 Y染色体长臂1区1带存在精子发生相关基因，称为无精子因子(AZF)。随后研究者将AZF分为AZFa、AZFb、AZFc、AZFd 4个区域，AZFa缺失可导致青春期精子发生阻滞，临床表现为“唯支持细胞综合征”无精子生成［6］;AZFb缺失可导致精子发生过程阻滞于精母细胞阶段，睾丸内仅见精原细胞和初级精母细胞，无精子生成;AZFc缺失的临床表现从正常精子到无精子各种表型［7］;AZFd缺失可导致不同程度的生精障碍形式。本研究共发现7例Y染色体微缺失，1例为有AZFb位点缺失患者，未检测到精子;5例为有AZFc位点缺失患者，其中3例有精子;1例为单独的AZFd位点缺失，可检测到精子，各缺失类型检测到的精子浓度都＜5×106/ml。

目前细胞遗传学分析采用外周血G显带分析的方式，这种方法可准确诊断各染色体数目和结构异常，但这种技术的精确度较低，不能可靠地检测低于5万～10万个碱基对或更小的基因组片段的缺失、重复或重排［8］。Y染色体微缺失检测采用多重PCR的方法，具有简单、快速、灵敏等特点，检测片段可达到1个碱基对即可对基因水平进行检测。刘晓翌等［9］研究发现细胞遗传学检测Y染色体有q12缺失及邻近部位q11．23缺失的病例却没有检测到AZF位点的缺失，说明细胞遗传学不能反映Y染色体上AZF缺失情况;Y染色体有缺失，不一定有AZF的缺失，染色体核型正常也不排除有AZF的缺失。本研究检测到1例46，XYq－，Y染色体长臂缺失患者，同时检测到AZF的缺失，由于Yq是DNA高度重复的区域，只有细胞遗传学检测到Yq11大片段或完全缺失时才会有AZF的缺失。同时检测到另外6例AZF缺失患者，其染色体核型是正常的。所以对无精症及严重少精症患者进行遗传诊断时要同时进行细胞遗传学分析和Y染色体微缺失检测。

不育患者染色体核型异常的发生率与许多因素有关，其中最重要的是基于病人精子计数的选择标准，特别是无精症及严重少精症患者有着较高的发生率［10］。Akgul等［1］在无精症患者中检测到 17．4%及严重少精症患者中检测到6.8%的染色体核型异常，而正常精液人群未发现异常。本研究只在无精症患者中检测到染色体核型异常，发生率为9．6%，与其他研究报道的8．5% ～14.3%结果相一致［10～12］。其中Klinefelter综合征发生率最高为4．1%与以前报道的 3．6% ～4．0%的结果相一致［13，14］。Y 染色体微缺失的发生率与实验室选取检测的STS位点，检测标准及人群的种族差异，检测方法及质控相关［15］。本研究只在无精症及严重少精症患者中检测到Y染色体微缺失，正常对照未见缺失且两者差异极显著。Y染色体微缺失发生率为9．6%，与国内外报道的8．2%～10．8%结果相一致，其中AZFc、AZFd位点发生率较高，是热点缺失区域［10］。

随着辅助生殖技术的应用，越来越多的不育患者选择辅助生殖的方式来获得后代，特别是一些无精症及严重少精症患者只有通过ICSI才能有获得自己后代的机会。由于ICSI操作越过了一些自然选择屏障，Y染色体微缺失或染色体异常的患者，具有将这些遗传缺陷垂直传递给后代的风险。不育父代将染色体异常传递给后代的概率为9．4% ～33．0%。此外，AZFa和AZFb完全缺失患者几乎不能从睾丸内获得精子［6，7］，只能通过供精来获得生育。因此，在辅助生殖前进行Y染色体微缺失筛查和细胞遗传学检测可减少不必要的睾丸穿刺取精，降低患者身体、精神上的伤害及减少经济损失，同时指导患者选择可行的生育途径。对于AZFc和AZFd缺失患者睾丸中凋亡的生殖细胞的比例显著增加，导致具有这些位点缺失且可检测到精子的患者的精子数目有进行性下降的风险，最终可发展至无精症。对于这些患者应及早治疗或精液冷冻保存，避免发展到有创伤的取精或不能生育的风险。此外，对于这些Y染色体微缺失或染色体异常患者，进行辅助生殖时，应选择种植前遗传学诊断，避免缺陷传递给后代。

总之，Y染色体微缺失及染色体核型异常是导致男性不育的主要的遗传原因，常导致男性出现无精症或严重少精症而不育。因此，为了较好的治疗及获得健康后代，需要进行Y染色体微缺失及细胞遗传学检测，同时也为辅助生殖提供遗传咨询及制定合理的治疗方案提供依据。

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