糖基化终产物对人牙周膜细胞增殖和NF－κB mRNA表达的影响

房 明，汪 涛，王 欣，王新文，王勤涛

(第四军医大学口腔医学院，陕西西安 710032)

牙周炎和糖尿病(Diabetes mellitus，DM)都是人类最常见的慢性疾病。许多研究证明牙周病与糖尿病之间有相互联系，并且已经将牙周病列为糖尿病的第六大并发症［1－2］。糖基化终产物(Advanced glycation end products，AGEs)是体内持续高血糖刺激下形成的非酶氧化的不可逆蛋白之一，与糖尿病的多种并发症均有密切关系［3］，当AGEs与人牙周膜成纤维细胞表面的特异性受体(Receptor of advanced glyation end products，RAGE)结合后可刺激细胞分泌炎症因子，加速细胞的凋亡过程等，继而对牙周组织的损伤和修复造成影响。NF－κB是一种重要的转录因子，参与诸多免疫调节作用，例如细胞凋亡、肿瘤坏死等［4］。有研究指出［5］，AGEs能抑制人牙龈成纤维细胞的增殖，并可促进基质金属蛋白酶－1的合成，导致胶原降解，加剧糖尿病病人牙周炎的进程。

本研究通过观察糖基化终产物对人牙周膜细胞增殖及NF－κB表达的影响，以期进一步探讨糖尿病伴慢性牙周炎的发病机制，并为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养基(HyClone，美国);胰蛋白酶、胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);I型胶原酶(Gibco，美国);人血清白蛋白(Sigma，美国);流式细胞分析仪(Beckman Coulter，美国);Power/PAC 300 电泳仪(Bio－RAD，美国);7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems，美国);细胞总RNA提取试剂盒 TRIZOL Reagent(Invitrogen，美国);SYBY Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)、TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit(宝生物工程有限公司);SW－CJ－2D型超净工作台(苏州净化设备公司);XDS－1B型倒置相差显微镜(重庆光电设备厂);CO2孵箱(Shellab，美国)。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜细胞原代培养

选取18～21岁志愿者因正畸减数而拔除的前磨牙，用含庆大霉素的PBS浸泡3～5 min后，普通PBS漂洗3遍，在无菌条件下锐性刮取牙根中部1/3的牙周膜组织，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块后平铺于培养皿内，加入3 mg/mL I型胶原酶消化45 min(37℃，50 mL/L CO2)，轻轻吹打，制成单细胞悬液进行离心(800 r/min，5 min)，弃上清液。将细胞沉淀含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基重悬，再次离心(800 r/min，5 min)，弃上清液，将细胞沉淀平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入1.5 mL含100 mL/L胎牛血清、200 U/mL庆大霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培养液，置37℃，50 mL/L CO2条件下进行培养。每3 d换液1次，待细胞生长汇合达80%时进行传代。

1.2.2 AGEs体外制备

根据文献［7］方法，分别取 0.5 g人血清白蛋白、3.0 g D －葡萄糖、1000 μg青霉素和500 μg庆大霉素加于10 mL浓度为0.5 mol/L的PBS(pH=7.4)中，避光 37 ℃孵育120 d。用 PBS(pH=7.4)充分透析以除去未结合的葡萄糖后，经荧光分光光度计扫描鉴定，其AGEs质量浓度为26.61 mg/mL。

1.2.3 AGEs对hPDLFs NF－κB mRNA 表达的影响

1.2.3.1 实验分组及处理

取生长状态良好的第5代牙周膜细胞，以3×105/mL密度接种于 25 cm2培养瓶，置 37℃，50 mL/L CO2条件下培养，待细胞生长汇合达80%时，弃原液，并随机分为阴性对照组(L组)、高糖组(H组)和 AGEs组(A组)。L组加入含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基;H组加入含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基;A组加入含5.5 mmol/L葡萄糖，AGEs 终末浓度为 100 μg/mL的DMEM培养基，继续培养。

1.2.3.2 Real Time PCR 检测 NF－κB mRNA 表达

分别于培养后12、24、36 h取各组细胞，采用TRIZOL Reagent一步法提取总RNA，紫外分光光度计定量后，按照反转录试剂盒说明书，反转录cDNA。以GAPDH为内参照，同时参照GenBank数据库，采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物，并由Takara公司合成，基因序列见表1。反应条件参考产品说明，进行荧光实时定量PCR检测，用ABI 7500 real time system SDS软件分析结果。

表1 引物设计基因序列

1.2.4 AGEs对 hPDLFs增殖能力的影响

同1.2.3.1 分组处理后继续培养 36 h 后，胰酶消化后弃上清，加入2 mL 7000 mL/L无水乙醇和1 mL PBS吹打混匀后，于4℃固定细胞24 h，用流式细胞仪检测细胞各周期的DNA含量，计算各组细胞在G1、S、G2期的比例，以%S+%G2反映细胞的增殖能力。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AGEs对 hPDLFs NF－κB mRNA 表达的影响

各组各时间点NF－κB mRNA表达量均以阴性对照组(L组)最低，AGEs(A组)组最高，各组间两两相比，在12、24、36 h时H组、A组均明显高于L组(P＜0.05);A组与H组相比，12 h时无统计学差异(P＞0.05)，24 h和36 h时差异均有统计学意义(P ＜0.05);各组组内各时间点 NF－κB mRNA表达量相比L组无统计学差异(P＞0.05);H组36 h时明显高于12 h和24 h(P＜0.05);A组各时间点之间差异均有统计学意义(P＜0.05)，即NF－κB mRNA表达随AGEs作用时间延长而增加，具有时间依赖性(表2)。

表2 各组不同时间点NF－κB mRNA的表达()

表2 各组不同时间点NF－κB mRNA的表达()

不同字母同组不同时间点相比，P＜0.05;★同一时间点内与阴性对照组相比P＜0.05;▲同一时间点内与H组相比P＜0.05

时间(h)L H A 12 0.996 ±0.009 1.104 ±0.059a★ 1.122 ±0.002a★24 0.977 ±0.058 1.086 ±0.051a★ 1.356 ±0.003b★▲36 0.946 ±0.160 1.811 ±0.006b★ 2.352 ±0.125c★▲

2.2 AGEs对hPDLFs增殖能力的影响

流式细胞仪检测结果如(图1)，经计算各组%S+%G2以A组最低，与H组、L组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)，H组与L组相比无统计学差异(P ＞0.05)(表3)。

图1 各组流式细胞仪检测结果

表3 3组细胞增殖能力的比较()

表3 3组细胞增殖能力的比较()

不同字母组间P＜0.05

分组%S+%G2 L 组 23.74 ±0.51a H 组 23.71 ±0.56a A 组 19.57 ±0.74b

3 讨论

糖基化终产物(AGEs)是一种非酶糖基化的大分子蛋白质，一旦形成便不可逆，在正常人体内可随年龄的增长而缓慢增加，但是在长期高血糖的刺激下会导致其形成加速，大量积聚［7］。关于AGEs对糖尿病病人持续高血糖状态下的牙周组织特别是牙周膜细胞的影响机制和方式，目前尚无定论。Murillo等［8］发现，AGEs可降低人牙龈成纤维细胞(hGF)和人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)的迁移率和附着率。Hyun Sook Kim等［9］发现单纯高糖培养环境对人牙周膜细胞增殖有一定的抑制作用。

NF－κB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，广泛存在于多种组织细胞中，激活后参与许多基因的转录调控，在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中发挥作用。近年的研究表明，NF－κB与细胞凋亡的关系密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控，具有抑制细胞凋亡及促细胞凋亡的双向作用［10］。AGEs与其受体RAGE结合后促使NF－κB活化，延长压制内源性自动调整的反馈抑制循环的时间［11］。Maczurek等［12］研究发现，AGEs与RAGE相互作用后，可通过激活细胞内信号转导通路诱发氧化应激并激，活核因子NF－κB而上调多种细胞因子的生成(如 TNF－α，IL－1β，IFN－γ)，参与组织损伤。

本研究通过Real Time PCR技术检测AGEs刺激不同时间下hPDLFs表达NF－κB的影响，并使用流式细胞仪检测了相应细胞的增殖情况，结果显示:AGEs对牙周膜细胞NF－κB mRNA的表达有明显加强作用，并且对牙周膜细胞的增殖有明显抑制作用。这一结果与上述研究结果一致。虽然高糖组对牙周膜细胞的凋亡和增殖有一定的影响，但其作用不如AGEs明显，提示在糖尿病病人的牙周病变中，AGEs对牙周组织的破坏可能起到了更重要的作用。汪涛等［13］发现牙周基础治疗后患有糖尿病伴慢性牙周炎病人的PD、AL、空腹血糖水平均有明显改善，但是对AGEs水平控制并不理想。因此，在临床治疗糖尿病伴慢性牙周炎的过程中，积极控制病人血糖的同时，如能有效地阻断AGEs与其受体RAGE的联合效应，可能会达到更佳的治疗糖尿病伴慢性牙周炎的效果。

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