高效液相色谱法测定老陈醋中的5-羟甲基糠醛

周婷婷，杨瑞学，宋 弋，张玉玉，吕 茜，倪元颖，李全宏，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083; 2.中国农业机械化科学研究院，北京100083)

高效液相色谱法测定老陈醋中的5-羟甲基糠醛

周婷婷1，杨瑞学2，宋 弋1，张玉玉1，吕 茜1，倪元颖1，李全宏1，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083; 2.中国农业机械化科学研究院，北京100083)

利用高效液相色谱法测定老陈醋中5－羟甲基糠醛(5－HMF)的含量，以5%甲醇水溶液为流动相，采用C18色谱柱，在284nm波长条件下检测样品中的5－HMF。结果表明，该方法快速、准确，在0.0143～0.1001μg范围内线性相关系数为R2=0.9994，平均回收率88.27%～96.69%，相对标准偏差为2.09%～4.70%。

老陈醋，高效液相色谱，5－羟甲基糠醛

1 材料与方法

1.1 材料与设备

三种不同品牌的老陈醋 北京美廉美超市; 5－羟甲基糠醛 纯度99%，Sigma公司;甲醇 色谱纯，北京爱希姆科技发展有限公司;0.45μm水系滤膜 蓝弋化工产品有限责任公司。

LC－20A高效液相色谱仪 配有LC－20AT洗脱泵、SPD－20A检测器、CTO－20A柱温箱、LC Solution工作站，岛津国际贸易有限公司;Venusil XBP－C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm) 博纳艾杰尔科技有限公司;LGJ－12冷冻干燥机 北京松源华兴科技公司;2000D型超纯水器 北京长风仪器仪表公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的配制 精确称取5－羟甲基糠醛(5－HMF)标准品0.0286g，用超纯水溶解，定容到100mL的容量瓶中，得到0.286mg/mL的5－HMF标准品储备液，于4℃条件下避光保存。

1.2.2 样品溶液的配制 取各种老陈醋样品50g，冷冻干燥后，取适量用超纯水溶解，用0.45μm的水系微孔滤膜过滤后，待HPLC分析。

1.2.3 分析测定条件 色谱条件:Venusil XBP－C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm);柱温:30℃;UV检测器，检测波长:284nm;流动相:甲醇－水(5∶95，v/v);进样量:20μL;流速:1.0mL/min。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法

采用冷冻干燥处理老陈醋样品，去除了挥发性干扰成分，比直接上样更准确，且有利于保护色谱柱。图1和图2分别为老陈醋经冷冻干燥进样和直接进样的色谱图。

图1 老陈醋经冷冻干燥进样测定色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of freeze－dried over mature vinegar sample

图2 老陈醋直接进样测定色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of over mature vinegar sample by direct injection

2.2 色谱条件优化

通过对流动相组分、比例和流速的优化，观察对应的色谱峰型和出峰时间，结果表明，当流动相组分为甲醇－水(5∶95，v/v)，等梯度洗脱，流动相流速1mL/min，检测波长284nm时，5－HMF标准溶液的色谱峰峰形最好，见图3。当流动相的甲醇的比例高于5%时，出峰时间早，基质干扰影响大，不利于实际样品的测定。

2.3 标准曲线和线性范围

取5－HMF标准品储备液，用超纯水稀释成质量浓度为2.86μg/mL的标准品工作液，精密量取5－HMF标准品工作液5、10、15、20、25、30、35μL，经优化的色谱条件注入液相色谱仪，重复3次，测定5－HMF峰面积积分值，取3次测定峰面积的平均值。以进样量为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标作图，得标准曲线，见图4。以峰面积与进样量作线性回归方程y= 7×106x+3773.1，R2=0.9994，结果表明，检测方法在进样量为0.0143～0.1001μg范围内呈良好的线性关系。

图3 5－HMF标样测定色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of 5－HMF standard solution

图4 5－HMF的标准曲线Fig.4 Standard curve of 5－HMF

2.4 重复性实验

取同一老陈醋样品的测定液，相同体积进样5次，分别按上述色谱条件测定其中5－HMF的含量，计算所测含量的相对标准偏差(RSD)为3.59%(见表1)，说明本方法用于测定老陈醋中5－HMF含量具有较好的重复性。

表1 重复性实验结果Table 1 The result of repeatability test

2.5 稳定性实验

取标准品储备液，室温放置。每1.5h进样1次，测定5次，分别进样20μL。结果表明，所测含量的相对标准偏差(RSD)为2.86%(见表2)，说明处理后的标准溶液在室温条件下6h内稳定。

表2 稳定性实验结果Table 2 the result of stability test

2.6 精密度实验

取上述制备的标准品工作液在上述色谱条件下连续7次进样，每次20μL。结果见表3。结果表明，同样浓度的标准品连续进样的RSD为0.19%，说明该方法的精密度较高。

表3 精密度实验结果Table 3 The result of precision test

2.7 加样回收实验

取同一老陈醋样品，分为3组，分别加入一定量2.86μg/mL 5－HMF标准品工作液，按上述色谱条件测定其中5－HMF的含量，计算本方法的回收率(见表4)。表4结果显示，3个水平的平均回收率分别为88.27%、96.40%和96.69%，变异系数为2.09%～4.70%。因此，利用本方法测定老陈醋中的5－HMF含量，灵敏度高，重现性良好。

表4 5－HMF加样回收率实验结果(n=3)Table 4 5－HMF recovery tests and corresponding relative standard deviations(n=3)

2.8 样品测定

选取市售的3种不同品牌的老陈醋，按1.2.2的实验条件制备样品溶液，用高效液相色谱测定5－HMF峰面积，分别代入回归方程，计算样品中5－HMF的含量，结果见表5。

表5 实际样品中5－HMF含量分析结果Table 5 Analysis results of 5－HMF contents in samples

检测结果表明，所选择的各品种老陈醋中均含有一定量的5－HMF，不同老陈醋的含量差别较大，这可能与老陈醋的品质、工艺和贮存时间的不同有关。

3 结论

本方法采用高效液相色谱定量检测老陈醋中5－HMF的含量。其前处理简单、易操作，准确度、精密度均较好，重现性良好。运用该方法检测不同品种的老陈醋中的 5－HMF含量，平均回收率为88.27%～96.69%，相对标准偏差为2.09%～4.70%。由于目前我国尚未制订老陈醋中5－HMF含量的检测方法，因而本方法的建立不仅可以为老陈醋标准方法的建立和质量的监控提供一个有力的参考，也为老陈醋和5－HMF的研究提供一个新的思路。

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Determination of 5－hydroxymethylfurfural (5－HMF)in over mature vinegar by HPLC

ZHOU Ting－ting1，YANG Rui－xue2，SONG Yi1，ZHANG Yu－yu1，LV Qian1，NI Yuan－ying1，LI Quan－hong1，*
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China; 2.Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences，Beijing 100083，China)

A method for the determination of 5－hydroxymethylfurfural by high－performance liquid chromatography in old mature vinegar was developed.Samples were analyzed on a C18column at 284nm using a mixture of methanol and water(5∶95，v/v)as the mobile phase.Within the linear range of 0.0143～0.1001μg，the method was accurate with the range of average recoveries rate and relative standard deviation of 88.27%～96.69%and 2.09%～4.70%，respectively.

old mature vinegar;high－performance liquid chromatography;5－hydroxymethylfurfural(5－HMF)

TS207.3

A

1002－0306(2012)08－0083－03

老陈醋是以高粱、麸皮、水为主要原料，以稻壳或谷壳为辅料，以大麦、豌豆为原料所制得的大曲作为糖化发酵剂，经酒精发酵后采用醋酸发酵，再经熏醅、“夏伏晒、冬捞冰”陈酿等工艺酿造而成的食醋［1］。在其生产工艺中，熏醅是十分重要的生产工序，它不仅可以增加老陈醋产品适应要求的色泽，而且还决定了老陈醋产品的独特风味［2］，在熏醅过程中发生的糖降解和美拉德反应，都会导致5－羟甲基糠醛的产生。5－羟甲基糠醛(5－Hydroxymethylfurfural，5－羟甲基－2－糠醛，HMF)，是葡萄糖或果糖等单糖化合物在高温或酸性条件下，催化脱水产生的一种醛类化合物，是美拉德反应的重要中间产物［3］，主要存在于可能发生美拉德反应和糖降解反应的食品中，如酱油［4］、酒类［5］、蜂蜜［6－7］、烘焙食品［8］、植物油［9］等，其含量是研究食品在加工贮藏过程中质量变化以及衡量相关产品质量优劣的一项重要指标。研究表明，5－羟甲基糠醛具有多方面的生理作用，食用过量可能对人体健康造成伤害［10］。因此，世界各国均对食品中羟甲基糠醛的含量做了限量规定，一般不得超过20mg/kg［11］。目前，5－羟甲基糠醛含量测定的方法主要有:高效液相色谱法［12］、气相色谱质谱法［13］、紫外分光光度法［14］。近年来，针对啤酒［15］、牛乳［16］、饮料［17］等食品，都已建立了相关的HPLC测定方法。然而对于老陈醋中5－羟甲基糠醛含量的分析还未见报道。本文采用高效液相色谱法，对老陈醋中的5－羟甲基糠醛进行定量测定，建立一种准确测定老陈醋中5－羟甲基糠醛含量的方法，为研究5－HMF对老陈醋功能及风味稳定性的影响提供参考。

2011－07－25 *通讯联系人

周婷婷(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:天然产物化学。

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD23B01)。