嗜酸乳杆菌和双歧杆菌益生特性的研究

田 芬，陈俊亮，粘靖祺，霍贵成，*

（1.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌益生特性的研究

田 芬1，陈俊亮2，粘靖祺1，霍贵成1，*

（1.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）

以两株嗜酸乳杆菌和三株动物双歧杆菌为研究对象，详细研究它们的耐胃酸性、耐胆汁盐性、抑菌性和抗药性。结果表明：五株益生菌具有良好的耐酸耐胆汁盐性，双歧杆菌的耐酸性较强于嗜酸乳杆菌；抑菌性和抗药性结果表明：五株益生菌对致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用，嗜酸乳杆菌的抑菌性较强于双歧杆菌；五株益生菌对三种抗生素乙酰螺旋霉素、链霉素和青霉素均敏感，敏感程度各异。

嗜酸乳杆菌，动物双歧杆菌，耐酸性，耐胆汁盐性，抑菌圈

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌（KLDS AD1和KLDS AD2）、动物双歧杆菌（KLDS 2.0001、KLDS 2.0002和KLDS 2.0604）、致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌 来源于东北农业大学教育部乳品科学重点实验室菌种库；TPY培养基 北京陆桥；优化的MRS培养基 胰蛋白胨10g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，Tween 80 1g，盐溶液各10mL，蒸馏水1L，pH5.8～6.0，121℃灭菌15min；盐溶液配方 醋酸钠50g/100mL，硫酸镁5.8g/100mL，硫酸锰2.5g/100mL，柠檬酸氢二铵20g/100mL，磷酸氢二钾20g/100mL；LB培养基 胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；固体培养基 LB培养基另加1.5%的琼脂；牛胆粉 北京奥博星；乙酰螺旋霉素、青霉素、链霉素 哈药集团三精制药。

Delta 320 pH计 梅特勒-托利多。

1.2 实验方法

1.2.1 五株益生菌对低pH和高浓度胆汁盐耐受性实验 用5mol/L HCl分别调节改良MRS、TPY液体培养基的pH为1.5、2.5、3.5、4.5；调节液体培养基中牛胆粉浓度为1、2、3、4、5g/kg[5]，灭菌（改良MRS培养基121℃，15min；TPY培养基115℃，15min）。取活化好的菌液50mL，6000×g离心15min[6]，收集菌泥，加10mL灭菌的生理盐水配成种子液，将种子液分别接入低pH和高浓度胆汁盐培养基中，接种量5%。于37℃培养；在0、2、4h分别取样，稀释倾注平板法活菌计数。平行实验两次。

1.2.2 五株益生菌对肠道有害菌群的抑菌性实验 利用药物纸片琼脂扩散法，将滤纸制成直径为6mm的圆形纸片（121℃灭菌30min），将活化好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌液稀释至105cfu/mL，取0.1mL涂布。益生菌菌液离心（6000×g，15min）后，收集上清液，将浸染上清液的药片分别贴于涂有致病菌的平板上，每个平板贴3个滤纸片，两两相距30mm左右[7-8]；于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈直径大小[9]，照相保留图片。平行实验三次。

1.2.3 五株益生菌抗药性实验 利用药物纸片琼脂扩散法，抗生素浓度分别为：乙酰螺旋霉素2240U/mL，青霉素2000U/mL，链霉素2000μg/mL[2-4]，将益生菌涂布在MRS和TPY琼脂培养基上后，将浸染抗生素的药片贴于平板上，于37℃培养48h，观察并测量抑菌圈直径大小，照相保留图片。平行实验三次。

2 结果与分析

2.1 五株益生菌对低pH和高浓度胆汁盐耐受性结果

图1 五株益生菌的耐酸性效果Fig.1 Effect of the acid tolerance of five probiotics

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌是人体肠道内重要的微生物，它们摄入后必须经过人体的高胃酸环境和十二指肠的高胆盐环境，才能充分发挥它们的益生效应，维持人体肠道菌群平衡[10]。许多研究表明，胃液pH因饮食结构不同而波动很大，一般pH在3左右[10]，空腹或食用酸性食物pH可达1.5，食用碱性食品pH可达4～5，食物通过胃的时间为1～2h[11]。十二指肠的胆盐浓度为0.3～3g/kg[12]，而食物通过十二指肠的时间相对极短，因此人的胃肠道属于高酸高胆汁盐环境[13]。该实验模拟人体肠胃道环境，研究五株益生菌对胃酸和胆汁盐的耐受性。

由图1可知，双歧杆菌比嗜酸乳杆菌更能耐低pH环境。嗜酸乳杆菌在pH1.5的环境下经过4h，活菌基本全被杀死；在pH2.5环境中经过4h，活菌数下降2个数量级，从最初的1.0×107下降到1.0×105。双歧杆菌在pH1.5环境中经过4h，活菌数下降4个数量级，从最初的1.0×108下降到1.0×104，在pH2.5环境中经过4h，活菌数下降幅度较小。嗜酸乳杆菌和双歧杆菌在pH3.5、4.5环境中经过4h，活菌数均没有下降，甚至还呈上升趋势，因为益生菌能缓慢适应这种不利环境，并开始生长[14]，正常胃液pH为3左右，所以得出嗜酸乳杆菌和双歧杆菌均具有良好的胃酸耐受性。

图2 五株益生菌耐胆盐性效果Fig.2 Effect of the bile tolerance of five probiotics

由图2可知，益生菌耐胆汁盐性的强弱为KLDS AD1＞KLDS 2.0604＞KLDS 2.0001＞KLDS AD2＞KLDS 2.0002。在胆盐浓度为1、2、3g/kg的条件下，经过4h，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的活菌数基本呈上升趋势；说明这五株益生菌对胆盐浓度≤3g/kg的环境均有抗性，能缓慢适应这种不利环境，并开始生长[14]；人体十二指肠的胆盐浓度为0.3～3g/kg，所以得出嗜酸乳杆菌和双歧杆菌均具有良好的胆汁盐耐受性。在胆盐浓度为5g/kg的环境中，经过4h五株菌的活菌数均呈下降趋势，嗜酸乳杆菌KLDS AD2和动物双歧杆菌KLDS 2.0002活菌下降幅度较大，下降不到一个数量级；综合得出，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌均具有良好的胆汁盐耐受性。

表1 五株益生菌的抑菌性实验结果Table 1 The restrain function of five probiotic strains aginst harmful bacteria

表2 五株益生菌的抗药性实验结果Table 2 The ability of five probiotic strains against antibiotics

2.2 五株益生菌对肠道有害菌群的抑菌性实验结果

图3 嗜酸乳杆菌对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制效果图Fig.3 The resistance effect of L.acidophilus against Staphylococcus aureus and Salmonella

图4 动物双歧杆菌对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果图Fig.4 The resistance effect of B.animals against E.coli and Salmonella

表1数据表明：嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌对三株致病菌均有抑制作用，嗜酸乳杆菌的抑菌性较强于双歧杆菌；KLDS AD1能更好地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，抑制效果好于KLDS AD2；KLDS AD2抑制沙门氏菌能力较好。动物双歧杆菌KLDS 2.0604能较好地抑制大肠杆菌和沙门氏菌，但对金葡没有抑制效果；而KLDS 2.0002抑制金葡能力较强。由此实验结果可知，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌能产生一些抑菌代谢物，如乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸等，以及细菌素、类细菌素、过氧化氢等[17]。

用高效液相色谱对五株益生菌的主体代谢产物进行了测定，初步验证以上结果。HPLC结果表明：动物双歧杆菌KLDS 2.0001、KLDS 2.0002和KLDS 2.0604代谢物中的乳酸、乙酸和甲酸总量占到总代谢产物的50%，且乙酸量偏大。嗜酸乳杆菌KLDS AD1和KLDS AD2代谢物中的乳酸和乙酸总量占到总代谢产物的50%，且乳酸量偏大。其他的细菌素、类细菌素等微量物质测定过程复杂，耗时长，该项研究正在进行中。

乳酸、甲酸、乙酸和丁酸等能降低环境中的氧化还原电势和pH，使不耐酸的细菌和需氧菌受到抑制。而细菌素、类细菌素、过氧化氢、菌体裂解成分等能促进肠道有益菌群的增殖，抑制腐败杂菌的生长[18]。嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等益生菌除了代谢产物能发挥益生特性外，还可粘附在宿主消化道内定植并存活下来形成生物屏障（占位效应），抑制病原菌在消化道粘膜上的粘附，并通过与病原菌竞争营养物质抑制病原菌生长，另外可防止毒素等有害物质的吸收并中和有毒物质[5]。

2.3 五株益生菌耐药性实验结果

图5 动物双歧杆菌对乙酰螺旋霉素和链霉素的抑制效果图Fig.5 The resistance effect of B.animals against acetylspiramycin and oxytetracycline

本实验选择目前临床上常用的三种抗生素，进行益生菌抗药性实验，具体为大环内酯类的乙酰螺旋霉素、氨基糖苷类的链霉素和青霉素[15-16]。由表2的数据可知，五株益生菌对三种抗生素均敏感，敏感程度各异。除嗜酸乳杆菌KLDS AD2对乙酰螺旋霉素的效果是中敏外，其他的对三种抗生素作用均属于高敏范畴。

FAO/WHO（Food and Agriculture Organization/ World Health Organization）在《用于食品益生菌安全性评价指导原则》中指出，益生菌存在的可能危害包括：益生菌进入血液引起人体全身性感染（菌血症和感染性心内膜炎）；可能产生有害的代谢产物对人体产生不良反应；另外需强调的是，在抗生素的选择压力下，益生菌菌株产生广泛的耐药性，还可以使抗药基因在菌株之间传播[20-21]。若这些与人体共生的细菌携带抗性基因，将对人类健康形成巨大威胁。而本研究筛选出的五株益生菌对乙酰螺旋霉素、链霉素和青霉素均无耐药性，结果偏向高度敏感，说明这五株益生菌具有广泛的应用前景，为进一步研究提供了依据。

3 结论

3.1 本文主要研究了两株嗜酸乳杆菌和三株双歧杆菌的益生特性，结果表明：嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌都有很好的酸和胆汁盐耐受性，双歧杆菌的耐酸性强于嗜酸乳杆菌，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的胆汁盐耐受性都很强，强度大小依次为KLDS AD1＞KLDS 2.0001＞KLDS 2.0604＞KLDS AD2＞KLDS 2.0002。

3.2 抑菌性结果表明：嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌对三株致病菌均有抑制作用，嗜酸乳杆菌的抑菌性较强于双歧杆菌。动物双歧杆菌KLDS 2.0604能较好地抑制大肠杆菌和沙门氏菌，但对金葡没有作用；而KLDS 2.0002较能抑制金葡。抗药性结果表明：五株益生菌对三种抗生素均敏感，敏感程度各异，即五株益生菌均不具有耐药性，说明这五株益生菌对人体健康有益。

3.3 五株益生菌均具不同的益生特性，各有优势也有劣势，为进一步实验提供了很好的思路和价值。

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Study on probiotic properties of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium

TIAN Fen1，CHEN Jun-liang2，NIAN Jing-qi1，HUO Gui-cheng1，*
（1.Key Lab of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

2 Lactobacillus acidophilus and 3 Bifidobacterium were regarded as the research subject to survey their acid and bile tolerance，antimicrobial susceptibility and drug resistance.Results demonstrated that five probiotic strains had strong tolerance to simulated gastric juice and bile salts，and Bifidobacterium strains displayed better acid tolerance as compared to L.acidophilus strains.Antimicrobial susceptibility and drug resistance data suggested that five probiotic strains inhibited E.coli，Staphylococcus aureus and Salmonella，and the resistance effect of L.acidophilus was stronger than B.animals.All of five probiotic strains could be sensitive to acetylspiramycin，streptomycin and penicillin，and different strains had different sensitivity.

Lactobacillus acidophilus；B.animals；acid tolerance；bile tolerance；inhibition zone

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0139-04

嗜酸乳杆菌和双歧杆菌都是人体肠道重要的益生菌群，双歧杆菌在成人肠道中约占肠道总菌数的3%～10%，在婴儿肠道占到91%以上[1]。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在肠道内的数目是评价机体健康程度的重要指标[2]，因为它们良好的保健功能，如具备酸和胆汁盐耐受性，粘附人体上皮细胞，定植肠道产生细菌素[3]，促进乳糖耐受性以及消化，降低肠道pH，改善胃肠道功能，降低胆固醇，降低氨和其他毒性物质，产生B族维生素，使遭受抗生素破坏的紊乱肠道菌群恢复正常，治疗和抑制轮状病毒引起的严重腹泻，刺激免疫反应[4]等。本实验以从人体肠道中筛选，并经16S rDNA鉴定的2株嗜酸乳杆菌和3株动物双歧杆菌为对象，详细研究这五株益生菌的耐胃酸、耐胆汁盐性、抑菌和抗药性等益生特性，以使其更好地被人体利用。

2011－06－29 *通讯联系人

田芬（1987-），女，硕士生，研究方向：乳品科学与微生物。

教育部长江学者和创新团队发展计划（IRT0959）。