超声辅助提取松茸抗氧化多糖工艺的研究

高 擎，游丽君，赵谋明

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

超声辅助提取松茸抗氧化多糖工艺的研究

高 擎，游丽君*，赵谋明

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

采用超声辅助热水浸提方法，在单因素实验的基础上，选取超声功率、超声时间和料液比为自变量，以松茸多糖得率和氧自由基清除能力为响应指标，利用响应面分析方法，确定超声辅助热水浸提松茸抗氧化多糖的最佳条件为：超声时间6min，超声功率243W，料液比1∶16。在此条件下，松茸多糖得率达到5.76%，氧自由基清除能力为423.800μmol Trolox/g；松茸多糖主要含有两个组分，分子量分别为321356u和19209u，其含量各占50.64%和49.36%。

松茸，响应面分析，多糖，氧自由基清除能力，分子量

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松茸子实体 东北野生；苯酚 广州化学试剂厂；浓硫酸 广州市东红化工厂；Trolox、FL、AAPH Sigma-Aldrich公司；其他试剂 均为分析纯。

UV-2100型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司；KQ5800超声清洗器 东莞市科桥超声波仪器有限公司；Thermo scientific光谱扫描多功能读数仪 芬兰；ALPHA1-4/2-4冷冻干燥机 Christ Co.Ltd.德国；Breeze高效凝胶渗透色谱仪 美国waters公司；TDL-5-A台式飞鸽离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 松茸粉末按照料液比1∶7（w/v）加入95%乙醇微沸回流3h，脱脂、脱色，过滤后取滤渣50℃烘干备用。

1.2.2 松茸多糖的提取方法 取2g预处理后的松茸，加入蒸馏水，超声后沸水浴提取2h，抽滤取滤液，加入4倍体积无水乙醇，置4℃冰箱过夜，4800r/min离心20min后取沉淀，加入10mL蒸馏水复溶得松茸多糖溶液。

1.2.3 响应面数学模型模拟分析最佳超声条件 采用Design Expert 7.0软件，以超声功率、超声时间和料液比三个因素为自变量，以松茸多糖得率和氧自由基清除能力（ORAC值）为响应值，设计响应面实验方案，确定最佳超声条件的因素和水平，建立数学回归模型，对工艺参数进行最优化分析，同时反映不同因素间的交互影响。因素水平设计方案见表1。

表1 响应面分析的因素与水平Table 1 Varieties and levels for response surface design

1.2.4 多糖的测定 采用苯酚-硫酸法[7]测定，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。

1.2.5 多糖得率的计算

多糖得率（%）=松茸多糖溶液中多糖总量（g）/所用松茸原料总量（g）×100%

1.2.8 数据统计与分析 每个实验重复三次，以松茸多糖得率和ORAC值的平均值为响应值，利用Design Expert 7.0软件分析响应面模型得到最佳工艺。

2 结果与讨论

2.1 响应面模型设计方案及实验结果

采用Design-Expert 7.0软件，得到表1的因素水平，制备15组松茸多糖水溶液，其中，中心点处重复5次，分别测定其多糖得率和ORAC值，设计方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案及实验结果Table 2 The response surface design scheme and experimental results

2.2 响应面模型分析与检验

以多糖得率为响应指标的响应面模型1的方差分析（ANOVA）结果如表3所示，以ORAC值为响应指标的响应面模型2的方差分析（ANOVA）结果如表4。

从表3中可以看出，模型1达到极显著水平，而失拟项不显著，模型拟合度为0.9812，校正后系数达0.9473，说明该模型变量与自变量之间的关系显著，回归方程与实际情况拟合度高，其实验设计是可靠的。表3同时表明，料液比和超声功率对多糖得率有极显著影响，超声时间作用不显著，各因素对多糖得率的影响大小顺序为料液比>超声功率>超声时间，超声时间与超声功率，超声功率与料液比对多糖得率的交互作用达到极显著水平。

表3 多糖得率响应面模型的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic Model 1

表4 ORAC值响应面模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic Model 2

根据各项的回归系数，并舍掉不显著项后，得到模型1的回归方程为：

多糖得率（%）=5.21+0.98B-2.42C+0.40AB+0.74BC-0.49A2-0.28B2-1.40C2

从表4中可以看出，模型2亦达到极显著水平，且失拟项不显著，模型拟合度为0.9685，校正后系数达0.9119，说明该预测值与实测值之间具有高度的相关性，模型与实际情况拟合度较高，其实验设计可靠。表4的分析结果显示，超声功率和超声时间对多糖得率有极显著影响，料液比有显著影响，各因素对ORAC值的影响大小顺序为超声功率>超声时间>料液比，并且超声时间与料液比，超声功率与料液比对多糖得率的交互作用达到极显著水平。

根据各项的回归系数，去掉不显著项后，得到模型2的回归方程为：

ORAC值（μmol Trolox/g）=389.66+74.90A-90.62B+ 85.11C+88.41AC-139.26BC+31.33A2-14.33B2+40.25C2

2.3 响应面分析因素之间的交互作用

超声波能增强细胞壁的渗透能力甚至破坏细胞壁，加剧细胞的破裂，使胞内物质溶出，并减少溶出物的颗粒大小，产生空化效应强化传质过程，促进毛细管效应[11-13]，从而达到提高提取率的效果。

图1a为超声时间和功率对多糖得率的影响。功率一定时，随着超声时间的延长，由于超声波导致细胞破裂，增强传质，同时空化作用对大分子可产生机械性断键作用[14]，多糖得率先缓慢增加再减少；时间一定且较短时，超声破壁和断键作用不明显，多糖得率变化不明显，但当时间延长后，胞内糖迅速溶出，同时糖链被不断打断至寡糖或单糖，从而导致多糖得率呈现先增加后减少的趋势。

图1b为超声功率和料液比对多糖得率的影响。料液比增加，超声波功率较低时，超声强度没有达到空化阀声压，很难产生空化作用，多糖得率减少；随着超声波功率的增加，超声波强度达到或超过了空化阀声压，此时空化作用明显，多糖得率增加；但当超声波功率过大，空气气泡没有足够的时间溃陷，超声波空化作用降低，且超声波对多糖的断键作用加强，多糖得率下降。

图1 响应面分析因素之间的交互作用Fig.1 Interaction of factors with response surface analysis

超声时间和料液比对ORAC值的影响如图1c中所示，随着超声时间和料液比的增加，多糖ORAC值显著增加。超声时间较短时，随料液比增加ORAC值略微降低；超声时间延长，多糖的ORAC值随料液比的上升逐步升高；料液比一定时，随超声时间的延长，ORAC值先减少后增加，且随料液比增加其上升趋势逐渐明显。

超声功率和料液比对ORAC值的影响如图1d中所示。低功率下，随料液比的增加，ORAC值呈上升趋势，然而当功率上升后，ORAC值随料液比的增加而呈逐步下降的趋势；在低料液比下，随超声功率的增加，ORAC值增加，料液比上升后，ORAC值随功率的增加而减小，交互作用图呈马鞍状。

究其原因，可能是超声波具有机械剪切和热作用[15]，在超声强度适宜的情况下，可能使大分子的多糖结构变得疏松，暴露其活性基团；而当超声强度过高时，其空化作用引起的断键作用又会导致多糖活性的降低。

2.4 最佳提取条件的确定和验证

利用Design Expert 7.0软件，综合考虑多糖得率、ORAC值两个响应指标和实验可行性等因素，得到最优超声工艺为超声时间5min，超声功率234W，料液比为1∶16，多糖得率和ORAC值的预测值分别为5.90%和410.139μmol Trolox/g。为了检验RSM分析的可靠性，采用上述最优工艺条件进行实验，重复实验3次，得到测定值分别为：多糖得率5.76%±0.05%，ORAC值（423.800±9.43）μmol Trolox/g，与模型预测值无显著性差异，证明用响应面方法来优化松茸多糖的提取工艺条件结果可靠，具有参考价值。

2.5 松茸多糖基本组分和成分分析

松茸多糖冷冻干燥后，测得其糖含量为47.93%，蛋白质含量为38.59%。由图2可知，在最优条件下提取出来的松茸多糖主要有两个组分，其中峰1平均分子量为321356u，含量为50.64%，峰2平均分子量为19209u，含量为49.36%。

图2 松茸多糖的分子量分布图Fig.2 The molecular weight of polysaccharide from Tricholoma matsutake

3 结论

本实验采用响应面方法，得到超声辅助热水浸提松茸多糖的最优工艺条件：超声功率243W，超声时间6min，料液比1∶16，此时松茸多糖得率达5.76%，ORAC值达423.800μmol Trolox/mg。经GPC分析，此松茸多糖主要含有两个组分，其分子量分别为321356u和19209u，其含量各占50.64%和49.36%。

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Study on optimization of ultrasonic assisted extraction of polysaccharides with anti-oxidant activities from Tricholoma matsutake

GAO Qing，YOU Li-jun*，ZHAO Mou-ming
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The effect of ultrasonic power，process time and material-solvent ratio on extraction of polysaccharides with anti-oxidant activities from Tricholoma matsutake was investigated.On basis of the results of single factors test，response surface analysis was used to optimize process condition according to the response of polysaccharide yield and oxygen radical absorbance capacity value.The optimal condition of ultrasonic power，process time and material-solvent ratio was 243W，6min and 1∶16 respectively.Under the optimal conditions，the yield and oxygen radical absorbance capacity value of polysaccharides was 5.76%and 423.800μmol Trolox/g.Gel permeation chromatography analysis indicated that polysaccharides comprised two components，the molecular weight was 321356u and 19209u，the content was 50.64%and 49.36%respectively.

Tricholoma matsutake；response surface analysis；polysaccharides；oxygen radical absorbance capacity；molecular weight

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0295-05

松茸（Tricholoma matsutake）又称松口蘑、松蕈，属担子菌门，担子菌纲，伞菌目，口蘑科，口蘑属[1]，是典型的外生菌根菌。松茸菇体肥厚、香气宜人、肉质细嫩、口味鲜美、营养丰富，具有强身理气之功效。日本的千原吴郎的实验表明，其子实体的热水提取物（松茸多糖类物质）对小鼠肉瘤S-180的抑制率高达91.8%，对艾氏腹水癌的抑制率为70%[2]。据文献记载，松茸有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗真菌、抗糖尿病、抗炎的功效[3]。多糖类是松茸主要的活性成分，其抗癌活性近几年来受到广大关注，它的作用机制主要是通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡实现。例如胡尚勤[4]等的研究发现，松茸多糖具有明显抑制病原菌的作用和抗肿瘤抗癌作用；在Kawamura等人的实验中，松茸中的抗癌基因蛋白可导致癌细胞的凋亡[5]等。近年来，关于松茸子实体粗多糖提取方法的研究主要为热水浸提法、酶提法、超声波和微波萃取法等。热水浸提法提出的主要是胞外多糖，提取率较低；酶提法有利于胞壁内多糖的溶出，提高多糖得率，但生产成本高，同时产物分离较困难；超声波辅助提取法是一种从植物中提取生物活性化合物的重要技术[6]，可以缩短提取时间，提高多糖得率，是提取多糖的一种有效和经济的辅助手段。然而，相关的研究都只单纯考虑松茸多糖得率的高低，却没有关注松茸多糖活性的变化，本文在以超声为辅助的前提优化工艺的过程中同时监控了多糖得率和氧自由基清除能力（ORAC值）两个指标，为松茸的开发利用提供数据基础。

2011－06－30 *通讯联系人

高擎（1986－），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

广东省产学研项目（2010A090200041）；广东省重大科技专项。