RP-HPLC测定茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量△

王光忠，邵贝贝，邓媛媛，黄婕，刘焱文

(湖北中医药大学 中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430061)

RP-HPLC测定茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量△

王光忠，邵贝贝，邓媛媛，黄婕，刘焱文*

(湖北中医药大学 中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430061)

目的建立茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量测定方法,为该提取物的质量控制提供依据。方法采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对茯苓乙醇提取物中茯苓酸进行定性定量分析，利用保留时间定性和外标两点法定量。结果此方法线性关系良好，茯苓酸线性回归方程为Y=565.41X+14.477(r=0.999 5)，平均回收率为99.76 %，RSD=1.13 %(n=6)。结论该方法简便、可靠，可作为茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量测定方法。

茯苓乙醇提取物；茯苓酸；RP-HPLC；含量分析

茯苓为多孔菌科真菌Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,又名茯菟、茯灵、松薯、松苓等,首载于《神农本草经》,列为上品[1]。茯苓味甘、淡、性平，归心、肺、脾、肾经。具有利水渗湿健脾，宁心的功能。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠等的治疗[2]。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、脂肪酸等成分[3]。现代药理学表明，茯苓三萜为该中药的重要功效物质。茯苓乙醇提取物主要含总三萜类物质，而茯苓酸为其主要三萜成分[4-5],，具有抗炎[6]、抗肿瘤[7]及集落刺激因子诱生剂[8]等作用。本实验采用高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法，对茯苓乙醇提取物中的茯苓酸(pachymic acid)进行含量分析研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient 1100 series高效液相色谱仪(G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器)，Aglient 色谱工作站，C18色谱柱；十万分之一天平(Sartorius BP211D)；万分之一天平(Metter Toledo AL204)。

1.2 试药

茯苓乙醇提取物由本实验室提供；茯苓酸对照品为本实验室自制,经面积归一化法测定后确认其纯度大于98 %。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil 100-5C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速为1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)；检测波长：210 nm，色谱图见图1。

图1 茯苓酸对照品及茯苓HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取减压至恒重的茯苓酸对照品3 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0.3 mg·mL-1的茯苓酸对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取茯苓乙醇提取物0.25 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，称定，浸泡30 min，超声30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，过滤；得续滤液即为供试品。

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取茯苓酸对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL,注入色谱仪中 ,测定其峰面积值。以对照品进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为：Y=565.41X+14.477，n=6。结果表明，茯苓酸在0.6～3.6 μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录茯苓酸的峰面积，RSD=0.44 %(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一样品溶液，分别于0，2，4，8，16 h各进样10 μL，记录茯苓酸的峰面积，RSD=1.30 %(n=6)，表明样品溶液在16 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取茯苓乙醇提取物6份，按样品含量测定项下的方法处理，并进行测定，结果表明茯苓酸的含量平均为2.72 %，RSD=1.38 %(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量茯苓乙醇提取物样品6份，每份0.125 g，分别精密加入对照品3 mg，照供试品溶液的制备方法处理，测定茯苓酸的含量，平均回收率为99.76 %，RSD=1.13 %，表明该方法可靠性强，结果见表1。

表1 茯苓酸加样回收试验

2.9 样品含量测定

分别取071820，071821，071822 3批茯苓乙醇提取物样品，按供试品制备方法制备溶液，按上述色谱条件测定，计算样品溶液中茯苓酸的含量分别为2.67 %，1.60 %，2.77 %。

3 讨论

茯苓三萜类成分具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫功能等多种生物活性。茯苓药材的乙醇提取物主要含三萜类成分，总三萜含量达40 %。本论文采用RP-HPLC分析方法，对茯苓乙醇提取物中的主要三萜类成分茯苓酸进行了分析研究，其研究结果可望为茯苓三萜有效物质部位的开发利用提供依据。

实验考察了甲醇、乙腈、三氯甲烷3种溶媒的提取效果，以甲醇提取制得样品的测定值较高，因此选择甲醇作为提取溶媒。考察了两种溶剂不同比例的洗脱效果，最终选择乙腈-0.2 %醋酸(82∶18)作为流动相。

由方法学研究结果和3批样品的测定结果看，本方法线性关系良好，精密度试验、稳定性试验、重现性试验和回收率试验均符合要求，表明该方法准确可靠，可用于茯苓乙醇提取物中茯苓酸的含量测定。

[1] 肖培根 新编中药志[M].III.北京:化学工业出版社,2002：8901.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：224.

[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草精选本[M].上册.上海:上海科学技术出版社,1999:554-554,1871.

[4] 张秀明.茯苓药理作用研究概况[J].中药材,2001,24(6):447-449.

[5] 杨树东,包海鹰.茯苓中三萜类和多糖类成分的研究进展[J].菌物研究,2005,3(3):55-61.

[6] GINER E M,MANEZ S,RECIO M C,et al.In vivo studieson the anti2inflammatory activity of pachymic and dehydrotumulosic acids[J].Planta Med,2000,66(3):221-227.

[7] GAPTER L,WANG Z,GLINSKI J,et al.Induction of apoptosis in prostate cancer cells by pachymic acid f rom Poria cocos[J].Biochem B iophys Res Commun,2005,332(4):1153-1161.

[8] 李静,黎红,许津.茯苓中集落刺激因子诱生剂的分离鉴定[J].中国药学杂志,1997,32(7)：401-403.

DeterminationofPachymicAcidinEthanolExtractofPoriacocosbyRP-HPLC

WANG Guang-zhong,SHAO Bei-bei,DENG Yuan-yuan,HUANG Jie,LIU Yan-wen

(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription,HubeiUniversityofTCM,Wuhan430061,China)

Objective: To determine the content of pachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosand provide the basis for the effective quality control of the material.MethodsPachymic acid in ethanol extract ofPoriacocosis derterminated by RP-HPLC with the retention time qualitative and external standard method quantitative.ResultsThe linear regression equation isY=565.41X+14.477(r=0.999 5),the average recovery is 99.76 %,RSD=1.13 %(n=6).ConclusionThe method is simple and reliable and can be used as a a quality control for ethanol extract ofPoriacocos.

Ethanol extract ofPoriacocos;Pachymic acid;RP-HPLC;Content analysis

国家自然科学基金项目(30970295)

*刘焱文，Tel：(027)88920834，E-mail：ywliu2008@163.com

2011-08-10)