人工牛黄中牛磺酸成分的含量测定

钟胜佳，石岩，熊婧，魏锋，肖新月，马双成，林瑞超

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.湖南省益阳市食品药品检验所，湖南 益阳 413000)

人工牛黄中牛磺酸成分的含量测定

钟胜佳2，石岩1*，熊婧1，魏锋1，肖新月1，马双成1，林瑞超1

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.湖南省益阳市食品药品检验所，湖南 益阳 413000)

目的建立人工牛黄中牛磺酸的含量测定方法。方法以异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂衍生后进行HPLC分析，采用C18色谱柱，柱温为43 ℃；醋酸钠缓冲液-乙腈体系为流动相，流速1.0 mL·min-1；检测波长为243 nm。结果牛磺酸在0.034～0.34 μg与峰面积呈良好线关系，r=0.999 9，平均回收率为102.19%，RSD=0.94%(n=6)。结论该方法结果准确、可靠，重现性好。

人工牛黄；牛磺酸；衍生化；高效液相色谱法；异硫氰酸苯酯

牛黄是牛科动物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥胆结石，系名贵中药材，但其资源匮乏，目前市场流通多以人工牛黄以及体外培育牛黄等牛黄替代品为主[1-2]。人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成，其配方较为复杂。其中的牛磺酸最早是由牛黄中分离得到的，具有抗疲劳、解热镇痛等作用，又名牛胆碱、氨基乙磺酸、2-氨基乙磺酸，是中药及保健食品中的重要指标性成分，其测定方法有薄层色谱法、化学滴定法、柱前衍生化液相色谱法、氨基酸分析仪法和比色法等，现行《中国药典》人工牛黄项仅收载了牛磺酸的薄层鉴别，缺少对其的含量测定方法[3-10]。由于牛磺酸最早是从牛黄中来，并且具有与牛黄相近的功效，所以对于人工牛黄中牛磺酸的质量控制仅仅停留在薄层鉴别上是远远不够的。本文针对牛磺酸无紫外吸收的性质，建立了柱前衍生化法，用以测定人工牛黄中的牛磺酸含量，取得了较好的结果。

1 仪器与试药

Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2489紫外/可见检测器，EMPOWER工作站。牛磺酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111616-201002)。

试剂：乙腈为色谱纯，醋酸钠、三乙胺、盐酸、醋酸为分析纯，异硫氰酸苯酯(PITC,购自Sigma公司，标示纯度≥99.0%)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent EclipseC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为43 ℃。以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸钠溶液(用醋酸调pH值至6.5)(7∶93)为流动相A，以乙腈-水(4∶1)为流动相B，进行梯度洗脱：0～12 min，0%→8%B；12～17 min，8%→100%B；17～18 min，100%B；18～30 min，100%→0%B；30～35 min，0%B。流速为1.0 mL·min-1；检测波长为243 nm；进样量为5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取牛磺酸对照品约16 mg，加水溶解并定容至100 mL，摇匀，即得牛磺酸对照品储备液。精密量取该储备液5 mL置于25 mL 量瓶中，加入0.1 mol·L-1PITC溶液2.5 mL和1 mol·L-1三乙胺溶液2.5 mL，室温放置60 min，加50%乙腈定容至刻度，摇匀，取10 mL，加正己烷10 mL，振摇，放置10 min，取下层溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取人工牛黄样品粉末约40 mg置于25 mL量瓶中，加水20 mL，超声15 min，再加水定容至刻度，摇匀。精密量取该溶液5 mL，按2.2.1项下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.2.3 空白溶液 精密量取水5 mL，按2.2.1项下方法自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.3 系统适应性实验

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各5 μL，按2.1项下色谱条件进行测定。结果牛磺酸色谱峰分离度良好，空白无干扰。理论塔板数按牛磺酸计为127 421，分离度大于1.5。HPLC图见图1。

A.空白 B.对照品 C.样品 1.牛磺酸图1 牛磺酸柱前衍生化HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

精密称取牛磺酸对照品约16 mg置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀。分别精密量取该溶液1,2,3，4，5，10 mL置于10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，再分别精密吸取上述对照品溶液5 mL，按2.2.1项下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，制成线性对照品溶液1～6。按2.1色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积，分别以牛磺酸对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y=6 552 614X-8 043，r=0.999 9，牛磺酸进样量在0.034～0.34 μg与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取一份对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积，计算得牛磺酸的RSD=0.30%，结果表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取1号样品溶液，按上述色谱条件分别于0，3，7，10，17，24 h进样，测定峰面积，计算得牛磺酸色谱峰的RSD=1.81%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取1号样品6份，每份约40 mg，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定含量，计算得牛磺酸含量平均值为10.55%(n=6)，RSD=1.68%。

2.8 加样回收试验

精密称取1号样品6份，每份约20 mg，精密加入牛磺酸对照品溶液(0.218 44 mg·mL-1)10 mL，按2.2.1项下方法操作，制备所需溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 牛磺酸回收率试验结果

注：牛磺酸对照品加入量均为2.184 4 mg

2.9 耐用性试验

为了考察不同色谱柱对测定结果的影响，特选取3个不同厂家色谱柱对1号样品进行测定，结果见表2。

结果表明用不同牌号色谱柱测得的供试品中牛磺酸含量相差不大，该方法对不同C18色谱柱耐用性良好。

2.10 样品含量测定

用上述方法对市售不同厂家的3批人工牛黄样品进行了测定，结果见表3。

表3 3批人工牛黄样品测定结果

3 讨论

分别考察了超声提取人工牛黄10，15，20 min的情况，发现超声提取15 min已经达到提取的最大值，故选择15 min为提取时间。

对衍生化后的牛磺酸对照品进行紫外扫描，发现243 nm为最大吸收波长，故选择243 nm为检测波长。

本文利用牛磺酸可与异硫氰酸苯酯结合成为稳定并且有较强紫外吸收的衍生化产物这一性质，研究建立了异硫氰酸苯酯柱前衍生法测定人工牛黄中牛磺酸的方法，并经过相关方法学验证，结果准确可靠，可以用作人工牛黄中牛磺酸指标的质量控制。

[1] 黄海萍，谭桂山.人工牛黄中胆红素研究进展[J].中国药事，2005，19(2)：114-116.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：65-66.

[3] 黄岛平，陈秋红，劳燕文.柱前衍生高效液相色谱法测定红牛维生素功能饮料中牛磺酸含量[J].广西科学院学报，2006，(S1)：419-421.

[4] 张彤，山广志，陈思.自动电位滴定法测定牛磺酸含量[J].首都医药，2009.5(下)：63-64.

[5] 谢继红，陈玉仁，唐少珍.高效液相色谱法柱前衍生化法测定牛磺酸含量[J].色谱，1994，12(4)：302-303.

[6] 郭丽仪.薄层扫描法测定人体血液中牛磺酸的含量[J].中草药，2001，32(3)：217-218.

[7] 谢京宇，李珠成，姜昊，等.HPLC测定增智营养片中牛磺酸及盐酸赖氨酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2008，14(8)：19-21.

[8] 胡德荣，张宏炼，徐志，等.珍珠精母口服液牛磺酸含量测定[J].中成药，1999，21(1)：15-16.

[9] 石岩，宋光西，熊婧，等.PITC柱前衍生化法测定保健食品中牛磺酸的含量[J].中国药事，2012，26(2)：144-146.

[10] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：5-7.

DeterminationofTaurineinArtificialCow-bezoanbyHPLCwithPrecolumnPhenylisothiocyanateDerivatization

ZHONG Sheng-jia2，SHI Yan1，XIONG Jing1，WEI Feng1，XIAO Xin-yue1，MA Shuang-cheng1，LIN Rui-chao1

(1.NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050；2.YiyangInstituteforFoodandDrugControl,Yiyang413000,China)

Objective：To establish an HPLC method to determine the content of taurine in artificial cow-bezoan.MethodsAn HPLC system was equipped with a C18column.Phenyl iso-thiocyanate(PITC) was used for the pre-column derivatization of taurine.The mobile phase consisted of sodium acetate buffer solution-acetonitrile-water.Flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 243 nm.ResultsThe linear range was 0.034～0.34 μg(r=0.999 9).The recovery was 102.19%，RSD was 0.94%(n=6).ConclusionThe method is accurate and practical,the result is satisfied.

Artificial cow-bezoan；Taurine；Derivatization；HPLC；PITC

*

石岩，Tel：(010)67095432，E-mail：san0373@yahoo.com.cn

2012-06-19)