HPLC法测定盐酸莫西沙星含量及其有关物质

马好

莫西沙星(moxifloxacin)是德国的拜耳公司研发出来的第四代的氟喹诺酮类超广谱抗生素，第三代的抗革兰阴性菌的活性被它保留了下来，它的8-甲氧基部分使抗革兰阳性菌的活性得到了显著提高，尤其是使对厌氧菌的抗菌活性得到了改善［1］。在1999年的时候德国首次上市，在2002年的时候在我国得以上市，拜复乐是其商品名［2］。因为其能快速吸收，且在体内的分布非常的广，较之于β-内酰胺类抗生素，在临床上治疗相当一部分的致病菌时莫西沙星的的疗效要更好一些［3］。2009年被英国药典收载的关于莫西沙星的质量标准里需要逐一的控制多个相关物质，结构图详见下图1，一般使用的是HPLC的分析方法，然而根据其标准借助于苯基硅烷键合硅胶柱来测定，在对峰定位对照品里的五个杂质进行分离时，分离度并不理想，所以笔者构建了通过常用的十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂的HPLC的分析方法，该方法有较好的专属性，极易操作，能够在测定盐酸莫西沙星的含量和相关物质含量时使用［4］。

图1 莫西沙星结构

1 材料

1.1 试剂和药品 盐酸莫西沙星对照品(纯度高达99.9%，批号是 MX-124-4)，盐酸莫西沙星(批号是 20100603，20100601，20100602)，它的螯合物，环合酯，(RS，SR)并不是对映异构体(批号是MX-100506-2)(制造商为江苏的永达药业有限公司);莫西沙星峰定位的对照品(制造商是深圳倍素特科技有限公司，批号是Y0000717，包括5～9种杂志)，甲醇(色谱纯，制造商是美国的Tedia有限公司)，剩下的别的试剂都是市售分析纯，所用的水是纯净水。

1.2 仪器 本次研究中使用的仪器主要有:德国赛多利斯公司生产的PB-20 pH计与BP190S天平;日本岛津公司生产的UV-2041紫外分光光度计及柱温箱;浙江大学的智能信息工程研究所生产的N2000色谱工作站;SPD-10Avp型紫外检测器与LC-10ATvp型高效液相色谱仪等等。

2 方法

2.1 色谱条件与系统的适应性 色谱柱是Sepax BR-C18(尺寸为250毫米×4.6毫米，5 μm);流动相是甲醇-缓冲液(是将0.5 g的四丁基硫酸氢铵、1 g的磷酸二氢钾及3.4 g的磷酸放入1升的水里溶解而成的)(28∶72)，检测流速是每分钟 1.3 ml，波长是 293 nm;柱温是 45℃;进样量:20 μl。

稀释液:在500 ml的水里放入0.5 g的四丁基硫酸氢铵与1 g的磷酸二氢钾并进行溶解，加入2 ml的磷酸，0.05 g的无水亚硫酸钠，在它们完全的溶解之后，加入1升的水进行稀释。

2.2 方法专属性

2.2.1 分离盐酸莫西沙星和相关的物质的效能 在生产过程中，进行盐酸莫西沙星的合成时或许会有相关物质的引进，所以需要进行分离。精密的称定5 mg的莫西沙星峰定位对照品，放在10 ml量瓶里，放入稀释液溶解且稀释至刻度，摇晃均匀，取出20 μl向液相色谱仪中注入，将色谱图(图2-A)记录下来，实验表明，莫西沙星能很好的和各种杂质分离开来，每一种杂质之间的分离度都超过了1.5，拖尾因子都低于2.0。结果详见图2(B～D)。

图2 色谱图

2.2.2 降解产物的检出和确定 在50 ml的量瓶里放入25 mg的本品，将3%双氧水5 ml，6 mol/L盐酸2 ml及1 mol/L氢氧化钠2 ml分别的加入进去，加热2 h后，并冷却至室温，将pH调节至中性，用稀释液稀释到刻度，摇晃均匀，将20 μL的续滤液取出并做检测。再取适量的本品，在130℃的烘箱里进行八小时的放置，在4 500 lx的光照条件中存放十天，取25 mg的光照与高温放样样品，放在50 ml的量瓶里，取20μL的续滤液20进样，将色谱图记录下来。结果发现，本色谱条件可以检测出盐酸莫西沙星的相关物质，对本品质量能进行有效的控制。

2.3 定量限和检测限 取适量的盐酸莫西沙星，借助于稀释液进行溶解同时进行逐级的稀释，在测定时取20 μL，用信噪比(S/N)3及10分布的来明确盐酸莫西沙星的定量限与检测限，经研究发现，6.25×10-3μg/ml是盐酸莫西沙星的检测限，0.025μg/ml则是其定量限。

2.4 耐用性试验 主要使用的是柱温(±5℃)、测波长(±5 nm)、不同色谱柱及调节流动相比例(±5%)，对主峰与相邻的杂质峰之间的分离度进行测量并观察主峰的纯度与拖尾因子，得出，在柱温各异的情况下盐酸莫西沙星的耐用性不好，但其余的色谱情况里的色谱行为都可以满足系统在适用性方面的要求，有理想的耐用性。

2.5 含量测定方法学

2.5.1 线性范围 经研究发现，盐酸莫西沙星在38.55～57.82 μg/ml的浓度范围里时能够和峰面积保持一个理想的线性关系。

2.5.2 进样精密度和重复性 经研究，发现该测定办法有较好的重复性与进样精密度。

2.5.3 稳定性 通过实验发现，在室温情况下，放置样品溶液8各小时后，溶液可以继续保持稳定。

3 讨论

3.1 检测波长的确定 取适量的本品原料，借助于稀释液稀释成10 μg/ml的溶液，在200～400 nm的波长范围里扫描，发现它的紫外的吸收波长的最大值是293.6 nm，因此，我们将293 nm视为检测波长。

3.2 选择色谱柱 在使用苯基柱对峰定位杂质对照品进行测定时，发现有五个杂质峰的分离度不理想，能分离出来的只有三个峰，对流动相比例是甲醇-缓冲液(23∶77)进行调节，依然无法全部检出五个峰全部检出(图略)。所以笔者构建了通过常用的十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂的HPLC的分析方法，该方法有较好的专属性，极易操作，能够在测定盐酸莫西沙星的含量和相关物质含量时使用。

3.3 控制柱温 通过耐用性的实验，我们发现在柱温40℃的情况下拖尾因子是0.77，而拖尾因子在柱温为50℃时是1.74，较低的柱温会造成色谱峰前沿长，但柱温高的情况下会导致色谱峰拖尾，所以我们在进行实验时应严格的控制柱温，切忌过高，避免造成拖尾。

［1］ 张亚坤，张志清，杨涛，等.盐酸莫西沙星氯化钠注射液在Beagle犬体内的药物动力学.中国医药工业杂志，2010，4(1):3-5.

［2］ 尹华，吴建敏，俞如英，等.HPLC法测定沙纳唑的含量及其有关物质.药物分析杂志，2003，2(4):31-32.

［3］ 王银兰，李晓玲，杨洁.反相高效液相色谱法分析注射用盐酸洛美沙星.宁夏医科大学学报，2008，30(2):251-253.

［4］ 黄玫.反相高效液相色谱法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液的含量.现代医药卫生，2011，1(1):29-30.