超高效液相色谱-质谱联用测定食品中叶酸含量

刘进玺，钟红舰*，董小海

(农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)，河南 郑州 450002)

超高效液相色谱-质谱联用测定食品中叶酸含量

刘进玺，钟红舰*，董小海

(农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)，河南 郑州 450002)

建立食品中叶酸含量的超高效液相色谱质谱联用测定方法。样品提取后以Acquity UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)为色谱柱分离，以电喷雾电离串联质谱在正离子选择反应监测模式下进行测定。以乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)为流动相、流速0.25mL/min、色谱柱温度40℃、进样量2μL，母离子m/z 442.3、定量子离子m/z 295.1、定性子离子m/z 176.0，碰撞能量为14eV。对空白试样进行3个添加水平4个重复的添加结果表明：回收率80.7%～89.7%，相对标准偏差2.90%～3.85%。该方法检出限1ng/mL，线性范围0.001～1.000μg/mL。该方法具有样品预处理简单、检测周期短、灵敏度较高等优点。

叶酸；食品；测定；超高效液相色谱-质谱

叶酸(folic acid)又称VM、VB9，是一种重要的B族维生素，具有促进泌乳、健美皮肤、防止白发、增进食欲和防治口腔溃疡的功效，是维持生物体正常生命过程所必须的一类有机物质。叶酸天然存在于部分食物当中，也作为添加剂被适量加入到一些营养强化食品、保健食品中，准确测定叶酸含量对产品的生产加工、功效评价等有重要意义[1]。目前对叶酸的测定标准仅有复合预混合饲料中的高效液相色谱法[2]和婴幼儿食品和乳品中的微生物法[3]，一般食品中叶酸的检测方法还未见。虽然有一些食品中叶酸含量检测方法的报道[4-15]，包括微生物分析法、高效液相色谱法、比色法、薄层层析法、荧光光度法等，但在实际工作中，以上几种检测方法均有比较明显的缺点。微生物法用于检测叶酸灵敏度高，但也存在许多局限性，如实验周期长、重复性差、检测结果不能区分各叶酸盐形式等；对于高压液相色谱法，由于一般食品中叶酸含量较低，紫外检测器几乎检测不出来，与杂质峰也很难分开，只能检测食品添加剂、药等一些杂质成分较少、叶酸含量较高的物质[16]；比色法、薄层层析法和荧光光度法较费时费力。因此研发一种快速、灵敏、适合于食品中叶酸的检测方法成为当务之急，这也是食品企业和科研机构近年来的一个研究热点。本实验利用超高效液相色谱质谱联用法测定叶酸的含量，结合超高效液相色谱和质谱的优点，分析速度快，灵敏度高，适用范围宽。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

叶酸标准品 中国药品生物制品检定所；乙腈、甲酸(均为色谱纯)；乙酸、抗坏血酸、碳酸钠、氨水(均为分析纯)；水(超纯水)。

KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Acquity超高效液相色谱仪 美国Waters公司；TSQ-Quantum质谱仪 美国Thermo公司。

1.2 仪器条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；色谱柱温度：40℃；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)；流速：0.25mL/min；进样量：2μL。

1.2.2 质谱条件

电喷雾正离子电离(ESI+)；锥孔电压：4000V；分辨率：0.7；母离子m/z 442.3；定量子离子m/z 295.1；定性子离子m/z 176.0；碰撞能量14eV。

1.3 标准溶液配制

精确称取叶酸标准品0.01g(精确至0.0001g)，用Na2CO3溶液(0.1mol/L)溶解，用1mol/L盐酸溶液调至pH7.0，用水定容至100mL，制得100μg/mL标准溶液，备用。临用前根据需要用流动相稀释成不同质量浓度的标准工作液。

1.4 样品前处理

1.4.1 称量

准确称取5～10g样品于100mL容量瓶中，加入0.5g抗坏血酸，70mL氨水溶液(质量分数0.5%)溶解，40℃水浴超声10min。

1.4.2 脱脂和去蛋白

加入2mL质量分数5%的乙酸溶液，再用氨水溶液(质量分数0.5%)定容。无脂和蛋白样品可不做此步骤。

1.4.3 离心与过滤

对于较混浊样品，需高速离心，取上清液过0.45μm滤膜，待上机。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的确定

叶酸在碱性条件下特别稳定，见光和受热不会分解[17]，而其他水溶性维生素则在酸性条件下稳定，故溶解样品时用质量分数为0.5%氨水溶液，可以避免其它水溶性维生素的干扰。在实验中分别对常温、30、40℃提取效果比较，结果表明40℃，提取10min的条件可以得到满意的效果。经过对乙腈、甲醇、高氯酸、硫酸铜、乙酸等溶剂进行筛选[18]，发现质量分数为3%高氯酸和0.1%乙酸对样品的去脂去蛋白效果较好，且按1.4节步骤处理叶酸标准品后，其回收率均可达80%以上。但考虑到实验的方便及对柱子的影响，最终确定样品前处理溶剂为质量分数为0.1%乙酸。

2.2 流动相组成优化实验

采用不同比例的乙腈-0.1%甲酸溶液进行实验，当乙腈-0.1%甲酸溶液的体积比为5:95时，叶酸与杂质分离效果好，分析时间适当，所以选用乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)作为流动相。

2.3 质谱条件优化

配制质量浓度0.5μg/mL的标准品溶液，在全扫描方式下通过六通阀进样，调节电离源各个参数得到较强的[M+H]峰。在该条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，优化碰撞能量等参数，将两个响应较强的子离子作为检测的碎片离子，选择其中多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)色谱图峰形好、响应值高的1个离子用于定量计算，确定定量离子m/z 295.1，定性离子m/z 176.0。叶酸的离子流色谱图和离子扫描质谱图见图1、2。

图1 叶酸空白加标0.1μg/mL的总离子流图Fig.1 Chromatogram of blank samples spiked with 0.1 μg/mL folic acid

图2 叶酸离子扫描质谱图Fig.2 Mass spectrum of folic acid

2.4 方法线性范围与检出限

准确移取叶酸储备液，用流动相依次稀释，配制成0.001、0.005、0.010、0.100、0.500、1.000μg/mL的标准溶液，以叶酸的质量浓度和峰面积为纵、横坐标，绘制线性关系曲线。结果可得线性回归方程为Y＝4.301×10-8A－0.0244，相关系数r＝0.9996，表明叶酸在0.001～1.000μg/mL范围内，叶酸的质量浓度和峰面积线性关系良好，适合做定量分析。

对空白样品进行不同水平的加标实验，按1.4节对样品进行前处理后，检测结果表明当RSN＞3时检出限为1ng/mL。

2.5 回收率与精密度

向不含叶酸的空白试样中添加10、50、200μg/100g三个水平的叶酸标样溶液，分别进行4次平行测定，结果见表1。由此可见，叶酸回收率在80.7%～89.7%，相对标准偏差为2.90%～3.85%，说明本方法比较准确。

表1 叶酸的回收率与精密度Table 1 Recovery rates and determination precision (RSD) of folic acid

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Determination of Folic Acid in Food by UPLC-MS/MS

LIU Jin-xi，ZHONG Hong-jian*，DONG Xiao-hai
(Center of Inspection and Testing for Agricultural Products(Zhengzhou), Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China)

A method for the determination of folic acid in food by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (UPLC-MS/MS) has been established. Sample extract was separated on Acquity UPLC BEH C18 column(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid (5:95, V/V) at a flow rate of 0.25 mL/min, and analyzed by electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) in a positive-ion selective reaction monitoring (SRM) mode at a collision energy of 14 eV using m/z 442.3, m/z 295.1 and m/z 176.0 as the parent, quantitative and qualitative ions, respectively. The column temperature and the injection volume were set as 40 ℃ and 2 μL, respectively.The average blank spike recoveries for 4 replicate determinations across three spike levels were in the range of 80.7%－89.7%with RSD of 2.90%－3.85%. The limit of detection was 1 ng/mL. An excellent linear relationship was achieved in the range of 0.001－1.000 μg/mL. The method was characterized by simple operation, time saving and high sensitivity.

folic acid；food；determination； ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

TS207.3；O657

A

1002-6630(2012)08-0233-03

2011-04-20

刘进玺(1981—)，女，助理研究员，硕士，研究方向为分析方法与检测技术。E-mail：liujinxi1020@163.com

*通信作者：钟红舰(1971—)，男，副研究员，硕士，研究方向为农(兽)药残留分析和相关代谢。E-mail：80456811@163.com