木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理特性及其转化硝酸盐影响因素的研究

赵亚娟，郇延军，孙冬梅，闫晓蕾，许 伟

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理特性及其转化硝酸盐影响因素的研究

赵亚娟，郇延军*，孙冬梅，闫晓蕾，许 伟

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

对普遍存在于发酵肉制品中具有硝酸还原酶活性的2种外源性木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理生化特性进行了鉴定，并研究了不同温度、pH、盐含量对两菌株及不同混合配比菌株生成亚硝酸盐量的影响。结果表明：两菌株均具有较强的耐盐性、耐亚硝性、耐硝酸盐性，且在30、40℃，pH6.5，2%NaCl时生成亚硝酸盐速率最快。生理生化等鉴定实验表明，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌可为发酵肉制品生产中的优良菌株选择和应用提供理论参考。

木糖葡萄球菌，肉糖葡萄球菌，硝酸盐还原，亚硝酸盐生成速率

硝酸盐和亚硝酸盐是肉制品加工中常用的添加剂，具有护色、抑制微生物生长的作用，特别是能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌生长，同时还具有提升腌腊风味的作用。但M irvish和Sen等研究发现，肉中NaNO2的浓度与亚硝胺产生密切相关，尤其是直接使用亚硝酸盐加工初期，肉中亚硝酸盐浓度较高，给亚硝胺大量生成创造了机会[1]。然而，在较长时间腌制和发酵肉制品生产中，通常使用硝酸盐或硝酸盐与亚硝酸盐混合物。硝酸盐可以在肉中还原性物质和产硝酸盐还原酶的微生物作用下，慢慢转化为亚硝酸盐，可避免直接使用亚硝酸盐带来的生产过程初期亚硝酸盐浓度过高等问题。2005年美国农业部提出了“天然肉制品”概念。这类产品生产中，所有配料必须是天然的[2]。而作为替代硝酸盐和亚硝酸盐天然配料的研究目前主要集中在使用芹菜和兰花菜等富含硝酸盐蔬菜上。Sebranek和Bacus[2]对应用芹菜粉和肉糖葡萄球菌进行肉制品加工做了简要介绍；Sindelar[3]等在牛肉干加工过程也应用了富含硝酸盐蔬菜。研究发现，发酵肉制品中的木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和一些微球菌是主要的产硝酸盐还原酶的微生物[2-4]。王永霞[6]、于长青[7]、Casaburi[8]等人对木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌具有硝酸还原酶活性进行了验证。硝酸盐在肉制品中添加使用历史很久，但对其转化为亚硝酸盐的影响因素没有细致研究。本文拟将研究2种外源性木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生理生化特性，并对其转化硝酸盐影响因素进行了系统分析和研究，以期为控制硝酸盐的转化和天然发酵肉制品品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylose，S.xylosus）、肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus，S.carnosus）均购于广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC）。

高压灭菌锅，超净工作台，生化培养箱，电子分析天平，UV2600紫外分光光度计，梅特勒－托利多（FE20）pH计。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物生理生化特性测定

1.2.1.1 生长曲线测定 将肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌在营养肉汁培养基中培养活化后，转接于空白新鲜液体培养基中，37℃培养24h，用分光光度计在可见光600nm处，每隔2h测定其OD600值，以空白培养基作为对照。

1.2.1.2 菌株耐盐能力的测定 在含0、3%、6%、9%、12%NaCl的100m L新鲜营养肉汁培养基中，分别接种1m L的在营养肉汁培养基中培养18h的菌悬液，37℃培养24h后测定其OD600值，以空白液体培养基作为对照。

1.2.1.3 菌株耐亚硝酸盐能力的测定 在含0、50、100、150mg/kg NaNO3的100m L新鲜营养肉汁培养基中，分别接种1m L的在营养肉汁培养基中培养18h的菌悬液，37℃培养24h后测定其OD600值，以空白液体培养基作为对照。

1.2.1.4 菌株耐硝酸盐能力的测定 在含0、50、100、150mg/kg NaNO3的100m L新鲜营养肉汁培养基中，分别接种1m L的在营养肉汁培养基中培养18h的菌悬液，37℃培养24h后测定其OD600值，以空白液体培养基作为对照。

1.2.2 温度对亚硝酸盐生成速率的影响 将在营养肉汁培养基中培养过夜的菌株分五组：单一的木糖葡萄球菌；单一的肉糖葡萄球菌；木糖葡萄球菌与肉糖葡萄球菌1∶1比例混合；木糖葡萄球菌与肉糖葡萄球菌1∶2比例混合；木糖葡萄球菌与肉糖葡萄球菌2∶1比例混合，分别接种于10m L含有250mg/kg NaNO3[8]的液体培养基中，放置在30、40、53℃条件下培养。每组接种量均为107cfu/g。用分光光度计法在波长538nm处测定溶液中亚硝酸盐生成量。以新鲜液体培养基及检测亚硝酸盐所用试剂为空白对照。

1.2.3 pH对亚硝酸盐生成速率的影响 将在营养肉汁培养基中培养过夜的菌株分组（同1.2.2），分别接种于pH为5.0、5.5、6.0、6.5的含有250mg/kg NaNO3[8]的10m L的液体培养基中。每组接种量均为107cfu/g。用分光光度计法在波长538nm处测定溶液中亚硝酸盐生成量。以新鲜液体培养基及检测亚硝酸盐所用试剂为空白对照。

1.2.4 盐含量对亚硝酸盐生成速率的影响 将在营养肉汁培养基中培养过夜的菌株分组（同1.2.2），分别接种于盐含量为2%、5%、10%的含有250mg/kg NaNO3[8]的10m L液体培养基中[8]。每组接种量均为107cfu/g。用分光光度计法在波长538nm处测定溶液中亚硝酸盐生成量。以新鲜液体培养基及检测亚硝酸盐所用试剂为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 生长曲线

从图1看出，木糖葡萄球菌在培养4h后进入对数生长期，17h后进入稳定期；肉糖葡萄球菌在培养6h后进入对数生长期，17h后进入稳定期。

对数期的微生物，生理特性整体较一致，酶系活跃，代谢旺盛，所以选用对数期的菌种作为实验菌种。

图1 菌株生长曲线Fig.1 Growth curves of S.xylosus and S.carnosus

2.2 菌株耐盐性

表1 不同NaCl浓度下两菌株的吸光值（A）Table1 Effectof the saltconcentration to S.xylosus&S.carnosus

由表1可知，NaCl含量对两种菌种生长均有不同程度的影响。木糖葡萄球菌在0～3%NaCl时生长不受抑制，在6%～12%NaCl时生长受到一定程度上抑制；而肉糖葡萄球菌在0～12%NaCl时随着NaCl浓度增大，生长受到一定程度上抑制。总的来说，这两种菌种在3%～6%NaCl时，均可正常生长。因而，从菌种耐盐性要求，可选用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌作为发酵香肠生产的菌种[9]。

2.3 菌株耐亚硝性

表2 不同亚硝酸盐浓度下两菌株的吸光值（A）Table 2 Effectof the nitrite concentration to S.xylosus&

由表2可知，NaNO2浓度对两种菌种生长均有不同程度的影响。当NaNO2浓度从0增加到50mg/kg时，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的吸光值均增加；当NaNO2浓度增加到100mg/kg时，木糖葡萄球菌生长基本无影响，而肉糖葡萄球菌的吸光值则增加；当NaNO2浓度上升到150mg/kg时，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生长受到影响很小。在应用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生产天然发酵香肠的过程中，添加芹菜粉、木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌后，芹菜粉中的硝酸盐被还原成亚硝酸盐，由表2可知，亚硝酸盐的生成不会对菌株的生长产生抑制作用。

2.4 菌株耐硝酸盐性

从表3可以看出，随着NaNO3浓度逐渐增大，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生长受到影响很小。在天然发酵香肠制作过程中，芹菜粉中含有一定量NaNO3，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在添加芹菜粉下可以正常生长。

表3 不同硝酸盐浓度下两菌株的吸光值（A）Table 3 Effectof the nitrate concentration to S.xylosus& S.carnosus

2.5 温度对亚硝酸盐生成速率的影响

图2 不同温度下各组菌种的亚硝酸盐生成速率Fig.2 Effectof nitrite formation rate of each strains at different temperatures

由图2可以看出，各组菌种在30、40℃时亚硝酸盐的生成速率及生成量远远高于53℃时处理组。图2（a）中，30℃和40℃下培养的木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌具有较强的硝酸还原酶活性，亚硝酸盐的转化率分别为54.59%和50.87%；亚硝酸盐的生成速率及生成量明显高于53℃情况下的生成速率和生成量；图2（b）中，30℃和40℃下的亚硝酸盐的转化率分别为62.85%和55.10%。

Stahnke LH[10]发现，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌能够产生酯类和其他来自氨基酸的一些重要风味物质，M－CMontel等人[11]将接种木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的香肠与不接菌的香肠风味对照，发现前者可以产生一种水果味。从香肠风味方面考虑，预采用混合菌种发酵剂。图2（c）、（d）、（e）中显示的是木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌不同配比混合菌种的亚硝酸盐生成和变化趋势，在30℃和40℃时均有较高的亚硝酸盐转化率。

Sindelar利用肉糖葡萄球菌制作天然牛肉干时，采用40.6℃作为其发酵温度[3]；Sebranek研究认为天然肉制品的生产均在35～40℃下发酵[2]。因而，利用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌中的硝酸还原酶活性能够还原芹菜粉中的硝酸盐为亚硝酸盐，但制作天然发酵香肠的发酵温度以30～40℃左右为宜。

2.6 pH对亚硝酸盐生成速率的影响

图3 不同pH条件下各组菌种的亚硝酸盐生成速率Fig.3 Effectofnitrite formation rateofeach strainsatdifferentpH

由图3可以看出，各处理组菌种在pH 5.0、5.5、6.0、6.5下均可将硝酸盐缓慢还原成亚硝酸盐，在反应12h左右，亚硝酸盐生成速率达到最大值，且在12～36h内亚硝酸盐含量基本保持稳定。图3（a）中，在0～12h内，木糖葡萄球菌在pH 6.0下亚硝酸生成速率最大，12h基本保持不变；反应36h后，木糖葡萄球菌在pH6.5下生成的亚硝酸盐最大。图3（b）中，0～12h内，肉糖葡萄球菌在pH 5.5、6.0、6.5下将硝酸盐还原成亚硝酸盐的速率明显高于pH 5.5处理组，且在pH 6.5下生成亚硝酸盐量最大。图3（c）、（d）、（e）显示，3种不同配比的混合菌种在pH6.5下的亚硝酸盐生成速率均最大，且无明显差别。3种不同菌种配比组合中，木糖葡萄球菌与肉糖葡萄球菌以1∶2比例混合时，硝酸盐还原率最大，达到59.28%。

在发酵香肠生产过程中，由于原料加入了食盐、硝酸盐和香辛料，使不耐盐腐败菌不能生长，加上加工过程中处理温度一般较低，嗜冷性好氧菌开始时生长缓慢，促进了乳酸菌生长，并使其逐渐成为优势菌。乳酸菌能将原料中的碳水化合物分解为乳酸，导致产品pH下降至5.0左右[12]，由此可见，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌在pH5.0下能够将硝酸盐还原成亚硝酸盐。

2.7 盐含量对亚硝酸盐生成速率的影响

图4 不同NaCl浓度下各组菌种的亚硝酸盐生成速率Fig.4 Effect of nitrite formation rate of each strains at different sodium chloride concentration

由图4可以看出，各处理组菌种在2%、5%和10% NaCl下均可将硝酸盐缓慢还原成亚硝酸盐，且以2% NaCl时亚硝酸盐生成率为最大，即木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌生长性能随着NaCl浓度增大受到不同程度的抑制，其硝酸还原酶活性可能也会受到影响，从而影响亚硝酸盐的生成速率。

在发酵香肠的生产过程中，随着水分含量降低，NaCl浓度会越来越大。在5%和10%NaCl条件下，木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的硝酸还原酶仍可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐，保证了香肠发酵过程中亚硝酸盐持续缓慢生成。

3 结论

通过对木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌2种菌种的耐盐性和耐亚硝性的测定，发现木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌能耐受6%食盐、150mg/kg亚硝酸盐及150mg/kg硝酸盐，且这2种菌种及其不同比例混合菌种在不同温度、pH、NaCl浓度条件下仍具有硝酸还原酶活性，尤其以30、40℃，pH 6.5，2%NaCl为适宜生长条件。

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Study on physiological，biochem ical characteristics and their influencing factors of nitrate reduction of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus

ZHAO Ya-juan，HUAN Yan-jun*，SUN Dong-mei，YAN Xiao-lei，XUW ei
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The g row th of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus which are two main kinds of staphylococcus existing in fermented meat p roduct，were evaluated by the salt-tolerant，nitrite-tolerant and nitrate-tolerant tests and their nitrate reduc tase activity at different tem peratures，pH and NaCl concentrations. The result showed that both of them had strong activity of nitrate reductases at 30，40℃，pH6.5，2%NaCl.The results showed that Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus can p rovide theoretical reference for the selection and app lication of strains in the p roduc tion of fermented sausages.

Staphylococcus xylosus；Staphylococcus carnosus；nitrate reduction；nitrite formation rate

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0063-04

2011－04－20 *通讯联系人

赵亚娟（1986-），女，在读硕士研究生，研究方向：肉品科学与品质控制。

国家自然科学基金课题（31071569）。