醋艾叶饮片HPLC指纹图谱研究暨异泽兰黄素和棕矢车菊素含量测定

周 倩，孙立立，于凤蕊

(1.山东省中医药研究院，山东济南250014;2.山东中医药大学，山东 济南250014)

艾叶来源于菊科植物艾Artemisia argyi levl.et Vant.的干燥叶［1］，艾叶主要含有挥发油类、黄酮类、鞣质类和三萜类等化学成分，具有散寒止痛，温经止血之功效，是妇科常用药。虽然艾叶的野生资源较为丰富，临床用量较大，但关于艾叶的研究报道却为数很少。另外，有的地区以野艾A.lavandulaefolia DC.叶作艾叶入药，但野艾叶疗效远差于艾叶［2］。2010版药典通过测定艾叶中桉油精的含量来控制生品艾叶质量，但是桉油精的含量受产地、采集时间和储存时间的影响较大［3，4］。课题组通过研究发现艾叶经醋炙后桉油精含量显著降低，更无法作为醋艾叶的质量评价指标。

中药指纹图谱能比较全面的反映中药中所含化学成分的种类和数量，从而反映中药的质量［5］，目前对醋艾叶指纹图谱的研究未见报道，尤其在现阶段艾叶的有效成分绝大多数没有明确的情况下，采用中药指纹图谱的方式，可以更全面反映其所含内在化学成分的种类与数量，进而控制其质量。植物黄酮在心血管、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、镇痛以及消化系统等方面均有一定的药理作用，艾叶黄酮是艾叶的主要活性物质，其中的异泽兰黄素［6］(5，7 － 二羟基 －6，3'，4'－ 三甲氧基黄酮)对血小板聚集有显著的抑制作用，是艾叶止血、抗凝血的活性成分，各产地艾叶中异泽兰黄素含量未见报道。

为更好的控制醋艾叶质量，本文收集了10个批次醋艾叶饮片进行测定，建立了HPLC指纹图谱，标定出14个共有特征指纹峰，可为醋艾叶的质量评价提供依据，采用指纹图谱色谱条件，同时对活性成分异泽兰黄素进行了含量测定，并同时测定了棕矢车菊素的含量，均可作为指标性成分控制艾叶质量。为有效区分艾叶和野艾，本研究同时收集了野艾醋炙品，与正品醋艾叶进行了指纹图谱及异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量比较，结果，二者指纹图谱有所不同，野艾醋炙品中异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量均显著低于醋艾叶，可明显区别二者，为临床用药的有效性提供了保障。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，Waters 2996 DAD检测器，1/10万电子天平(Sartorius R200D，德国)。LC－350A超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂)。

1.2 试药 本研究收集了11批不同产地的艾叶，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定，样品S－11为野艾，其余均为菊科植物艾的干燥叶。棕矢车菊素、异泽兰黄素对照品由实验室自制，经HPLC检测纯度大于98%。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甲醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。样品产地来源见表1。将各批艾叶制备为醋艾叶饮片，方法如下:将辅料醋与适量水混匀，淋入净艾叶饮片中拌匀，闷润，220℃炒制28 min，取出，晾凉。100 kg艾叶用醋15 kg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色谱柱;以乙腈(B)－0.2%甲酸(A)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序见表2;检测波长330 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱温:25 ℃。

表1 样品产地来源信息表

2.2 对照品溶液的制备 取棕矢车菊素、异泽兰黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含棕矢车菊素、异泽兰黄素对照品分别为40 μg、60 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取各供试品粉末0.5 g，精密称定，精密加入80%甲醇20 mL，称重，超声提取1 h，放凉，再次称重，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定。

表2 流动相梯度洗脱程序

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取样品S－3醋艾叶供试品溶液连续进样5次，记录指纹图谱。以异泽兰黄素的色谱峰为参照峰，计算各特征指纹峰的相对保留时间和相对保留峰面积。结果，各共有特征指纹峰的相对保留时间的RSD值在0.01%～1.81%，相对保留峰面积在 0.66% ～2.89%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.5.2 重复性试验 精密称取样品S－3粉末5份，照“2.3项下供试品溶液制备方法”制备5份供试品溶液，分别进样并记录指纹图谱。结果，各共有特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.01% ～0.91%、0.11% ～2.64%之间，表明本方法重现性良好，符合指纹图谱要求。

2.5.3 稳定性试验 将室温下放置的样品S－3的供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h进样分析，记录指纹图谱。结果，各共有特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.01% ～0.90%、0.08% ～2.86% 之间，表明样品溶液在12 h内稳定。

图1 混合对照HPLC图谱

图2 醋艾叶对照指纹图谱

2.6 指纹图谱的建立及相似度评价

图310 批醋艾叶HPLC图谱(R为生成的对照图谱)

2.6.1 醋艾叶饮片指纹图谱共有模式的建立 运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对10批醋艾叶饮片的指纹图谱进行相似度分析，以S－1号样品色谱图作为参照图谱，经过多点校正、自动匹配，以中位数法，生成对照图谱R，由匹配数据的输出结果得到共有峰共26个，通过峰面积的比较，选取峰面积较大且稳定的图谱共有峰，最后标定了14个共有特征指纹峰，结果见图2。

参比峰的选择:异泽兰黄素的色谱峰(13号色谱峰)在各批次样品图谱中分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定其为参照峰。

以异泽兰黄素保留时间和峰面积为参照，对10批样品中14个特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计分析，结果分别见表3、表4。

2.6.2 相似度评价 使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对10批醋艾叶指纹图谱进行相似度分析，结果，10批次醋艾叶饮片与相应对照图谱的相似度在0.979～0.997 之间，均大于0.90，符合要求，结果见表5。

表3 10批醋艾叶共有特征峰相对保留时间

表4 十批醋艾叶共有特征峰相对峰面积

表5 与共有模式比较的醋艾叶相似度

2.7 醋艾叶、野艾醋炙品HPLC图谱比较 取野艾醋炙品，照2.3项下方法制备供试品溶液，照HPLC指纹图谱条件进行测定，将采集图谱与醋艾叶对照图谱比较，分析二者差别，主要色谱峰峰面积比较，结果见图4和表6。

将野艾叶醋炙品HPLC图谱与生成的对照图谱R比较发现，野艾醋炙品HPLC图谱与对照图谱存在较大差异，野艾叶中37.354和41.941 min色谱峰峰面积明显小于正品醋艾叶，46.571 min色谱峰在野艾醋炙品中未检出，野艾醋炙品较正品醋艾叶多出A色谱峰。结果见图4。将野艾叶与对照图谱R峰面积比较，野艾叶醋炙品极性较大的成分较多，极性小的成分峰面积明显小于正品醋艾叶。

图4 醋艾叶对照图谱R与野艾醋炙品HPLC图谱比较(上为醋艾叶，下为野艾醋炙品)

表6 正品醋艾叶与野艾醋炙品比较结果

2.8 异泽兰黄素和棕矢车菊素含量测定 采用HPLC指纹图谱条件，以外标一点法测定不同产地醋艾叶中异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量，结果见表7。

表7 不同批次醋艾叶异泽兰黄素和棕矢车菊素含量测定结果

由上表可见，10批醋艾叶之间含量存在一定差异，异泽兰黄素含量在0.10% ～0.17%，棕矢车菊素含量在0.10%～0.22%，道地产区安徽及艾叶的主要产区三个产地的含量均较高。野艾叶醋炙品中异泽兰黄素和棕矢车菊素含量分别为0.04%、0.07%，明显低于各批次醋艾叶。

3 讨论

建立中药指纹图谱，色谱条件的优化是关键。本研究通过色谱条件优选，结果选择乙腈－0.2%甲酸作为流动相，各峰的保留时间适中，分离度较好，且基线稳定，有利于指纹图谱的分析，因此采用乙腈－0.2%甲酸水作为流动相系统;实验中比较了室温(25℃)、30℃下的分离效果，结果表明柱温对分离效果影响不大，因此柱温选择为室温(25℃);通过比较210、230、254、280 和 330 nm 波长下的液相色谱图，发现330 nm条件下色谱峰面积较大，色谱峰分离度最好，色谱图基线噪音较低，因此选择330 nm为检测波长。

采用研究确定的指纹图谱色谱条件对10批不同产地醋艾叶进行了指纹图谱分析，将艾叶指纹图谱评价标准暂定为14个特征峰。通过测定，市售醋艾叶与生成的对照图谱比较相似度良好，均大于0.90。不同产地醋艾叶指纹图谱在相对保留时间上具有较高相似性，但在相对峰面积上又不完全一致，可能是由于生品艾叶生长环境不同，导致其醋炙品的质量存在差异。采用HPLC色谱条件测定了10批醋艾叶中异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量，结果异泽兰黄素含量在0.10% ～0.17%，棕矢车菊素含量在0.10% ～0.22%，可作为指标成分控制醋艾叶质量。

通过野艾叶醋炙品HPLC图谱与生成的醋艾叶对照图谱R比较，野艾叶中色谱峰A为野艾特有色谱峰，14号色谱峰为10批艾叶共有峰，但野艾没有。异泽兰黄素和棕矢车菊素含量测定结果可见，野艾叶醋炙品中异泽兰黄素和棕矢车菊素含量明显低于各产地的醋艾叶，这些特征均可用于区别艾叶与野艾叶。

本研究首次建立了醋艾叶HPLC指纹图谱及异泽兰黄素和棕矢车菊素的含量测定方法，得到的色谱图主要色谱峰分离度较好，基线平稳，可为醋艾叶的全面质量控制研究提供参考。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:83.

［2］陈宗良，张慧芳.艾叶，野艾及细艾叶的比较鉴别［J］.中药材，1999，22(5):235 －237.

［3］靳然，于密密，赵百孝，等.不同年份蕲艾叶及不同比例艾绒化学成分研究［J］.中国针灸，2010，30(5):389 －392.

［4］梅全喜，高玉桥.艾叶化学及药理研究进展［J］.中成药，2006，28(7):1030 －1032.

［5］陈根顺，徐丽芳，李鹏.草珊瑚的HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2011，42(2):293 －295.

［6］梅全喜.艾叶的药理作用研究概况［J］.中草药，1996，27(5):311－314.