乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1－34)

陈耀国

(上海联合赛尔生物工程有限公司，上海201206)

骨质疏松症(Osteoporosis)是一种以由骨强度受损导致骨折危险增加为特征的骨骼疾病，是严重影响老年人身体健康的三大疾病之一［1］。1996年，WHO世界骨质疏松症大会上达成共识，认为治疗骨质疏松症的理想药物是甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)。

人甲状旁腺激素是由甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸的激素，最初合成产物是含115个氨基酸的前甲状旁腺素原，在分泌过程中切除N端的31个残基后，形成成熟的由84个氨基酸组成的单链多肽激素。通过受体介导，PTH能够激活腺苷酸环化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等产生cAMP、IP3、Ca2+和二酰基甘油等胞内二级信使［2］。rhPTH(1－34)是第一种用于临床的治疗骨质疏松症的PTH类似物，它于2002年11月由美国FDA通过，商品名为特立帕肽，主治绝经后妇女骨质疏松症和原发性骨质疏松症，并于2003年初在美国上市［3］。乳糖无毒性，价格便宜，可在pET系统中用于诱导宿主菌表达重组产物［4］。本文以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，对乳糖诱导表达目的蛋白的条件进行了优化。

1 材料

1.1 菌株 Escherichia coli BL21(DE3)含 pET28a(+)－PTH重组质粒，由公司研发工艺部提供。

1.2 培养基 摇瓶培养基选用LB培养基:蛋白胨(10 g·L－1)，酵母粉(5 g·L－1)，NaCl(10 g·L－1);发酵罐基础培养基为半合成培养基:葡萄糖(5 g·L－1)，蛋白胨(10 g·L－1)，酵母粉(5 g·L－1)，KH2PO4(2 g·L－1)，K2HPO4(4 g·L－1)，Na2HPO4(7 g·L－1)，(NH4)2SO4(1.2 g·L－1)，MgSO4(0.5 g·L－1)，泡敌 0.02%(v/v);补料液:葡萄糖(300 g·L－1)，蛋白胨(50 g·L－1)，酵母粉(50 g·L－1)，MgSO4(3 g·L－1);乳糖诱导液:乳糖(200 g·L－1);全部培养基pH调至7.0。

1.3 试剂 蛋白胨、酵母粉(英国Oxoid公司);异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖(上海生物工程有限公司);SDS，甘氨酸，Tris(Sigma公司);30% 丙烯酰胺－双丙烯酰胺溶液(美国伯乐公司);卡那霉素(荷兰Duchefa Biochemie公司);Marker(分子量范围14 400～97 400，上海升正生物公司)。

1.4 主要设备 HZQ－X100恒温振荡培养箱(江苏太仓市华美生化仪器厂);UV2000分光光度计(美国尤尼柯公司);Centrifuge 5810R高速冷冻离心机(德国艾本德公司);PAC 1000电泳仪(美国伯乐公司);BIOTECH－5BG－4发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司);Gel Doc EZ Imager凝胶成像系统 (美国伯乐公司)。

2 方法

2.1 菌体生长及目的蛋白表达量的测定方法

2.1.1 菌体生长情况以A600确定 将发酵液稀释一定的倍数，测定600 nm波长下的吸光度，使测定值在0.3与0.7之间［5］，A600= 稀释倍数 × 吸光度。

2.1.2 目的蛋白表达量的分析 取诱导后的发酵液12 000 r·min－1离心10 min后去上清，洗涤再离心后，按文献［5］的方法进行SDS－PAGE电泳，丙烯酰胺的浓度为15%;通过凝胶成像系统分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。

2.2 乳糖诱导表达目的蛋白

2.2.1 摇瓶培养条件优化 ①确定乳糖最佳诱导浓度:取甘油菌1‰接种到50 mL(250 mL锥形瓶)含50 mg·L－1卡那霉素的LB培养基中，37℃，200 r·min－1，培养12～15 h进行菌种活化。将活化好的菌液以2%的接种量加入到50 mL(250 mL 锥形瓶)LB 培养基中，37 ℃，200 r·min－1，培养2～4 h(A600≈1.0)时，分别向9个摇瓶添加终浓度为0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5% 和 2.0% 的乳糖，继续培养4 h后，各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE电泳并用凝胶成像系统分析蛋白表达量;②确定乳糖最佳诱导时间:将活化好的菌液以2%的接种量加入到50 mL(250 mL锥形瓶)LB培养基中，37℃，200 r·min－1，培养 2～4 h(A600≈1.0)时，向摇瓶中添加最佳浓度的乳糖，于诱导0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 和 7 h 各取 1 mL 菌液做全菌 SDS －PAGE电泳并用凝胶成像系统分析蛋白表达量。

2.2.2 发酵罐培养条件优化 ①间歇补料培养:在5 L发酵罐加入基础培养基3 L，115℃灭菌，接种量6%，通气量200 L·h－1，通过流加氨水调节pH为7.0，溶氧上升到80%后加入100 mL的补料液，待溶氧回升至80%后再次加入100 mL的补料液，如此间歇补料，整个过程保持溶氧不低于30%。A600达到19～20时，加入100 mL的乳糖诱导液诱导，于诱导0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE电泳并用凝胶成像系统分析蛋白表达量;②分批补料培养:在5 L发酵罐加入基础培养基3 L，115℃灭菌，接种量6%，通气量200 L·h－1，通过流加氨水调节pH为7.0，溶氧上升到80%后开始按80 mL·h－1的速度流加补料液，整个过程保持溶氧不低于30%，A600达到19～20时，加入100 mL的乳糖诱导液诱导，于诱导0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE电泳并用凝胶成像系统分析蛋白表达量。

3 结果

3.1 乳糖最佳诱导浓度的确定 为确定合适的乳糖诱导浓度，分别以0～20%不同浓度的乳糖诱导。实验结果如图1，在菌体A600达到1.0时加入乳糖，随着乳糖浓度的提高，在一定范围内目的蛋白的表达量也随之提高，当乳糖浓度为0.6%时，目的蛋白的表达量达到最大，占总蛋白的 56.8%。此后随着乳糖浓度的提高，目的蛋白的表达量有所减少。同样，随着乳糖浓度的提高，诱导4 h后的菌体A600也随之增加，在乳糖浓度为0.6%时达到最大值(如表1)，这说明乳糖能促进菌体的生长。但乳糖浓度大于0.6%时诱导4 h后的菌体A600开始下降，这可能由于高浓度的乳糖对菌体生长有抑制效应。

表1 不同浓度乳糖的诱导结果

图1 乳糖浓度的确定

3.2 乳糖最佳诱导时间的确定 在菌体A600达到1.0时加入0.6%的乳糖，37 ℃，200 r·min－1振荡培养，在各时间点取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE电泳分析。从图2电泳结果可知，加入乳糖后，随着时间的延长，目的蛋白占总蛋白的比值逐步升高，在4 h时达到最高(54.6%)，并且杂蛋白表达量较少，之后目的蛋白逐步减少。

图2 诱导时间的确定

表2 不同诱导剂诱导后菌体生长情况

表3 不同诱导时间的诱导结果

从表2可以看出，相同时间点，加入乳糖比加入IPTG的菌体A600要高得多，说明IPTG可能对菌体生长有毒害效应;而乳糖对菌体生长有促进作用。从表3可以看出，乳糖诱导4h时目的蛋白的比值达到54.6%，这比最佳诱导条件下IPTG诱导的目的蛋白表达量要高(1 mmol·L－1IPTG诱导，目的蛋白表达比值约为47.6%)。

3.3 发酵罐培养 发酵初期溶氧持续下降，培养至4～5 h左右，溶氧上升到80%时，表明发酵罐里的营养物质基本耗尽，开始间歇加入补料液(A－间歇补料培养)和按80 mL·h－1的速度流加补料液(B－分批补料培养)，溶氧迅速下降，通过调节转速(500～700 r·min－1)和增加通气量保持溶氧不低于30%，A600达到19～20时，加入100 mL的乳糖诱导液诱导，于诱导0 h、3 h、4 h和5 h各取1 mL菌液做全菌SDS－PAGE电泳并用凝胶成像系统分析蛋白表达量。两种培养方式诱导4 h时，目的蛋白比值都达到最高，间歇补料培养方式的目的蛋白的比值仅有30.1%，而分批补料培养方式的目的蛋白比值达到了42.6%，可能间歇补料时一次性加入的葡萄糖过多，影响了乳糖的诱导效果。

图3 发酵培养比较

4 讨论

本文以乳糖作为诱导剂诱导表达rhPTH(1－34)，当乳糖浓度为0.6%、诱导时间4 h时，乳糖诱导效果好于IPTG。当乳糖浓度为0.6%时，目的蛋白的表达量达到最大，乳糖浓度增高反而抑制了目的蛋白的表达，这可能是由于乳糖从胞外转移至胞内需要β－半乳糖苷透过酶的作用，这是一种主动运输的过程，高浓度的乳糖会造成菌体质子推动力的消耗，从而“分散”了菌体的能量［6］。此外，本文对5 L发酵罐高密度培养工艺进行了初步研究，结果显示连续分批补料培养效果好于间歇补料方式。

［1］刘丰亮，常宏，刘洁，等.重组人甲状旁腺素的原核表达及发酵条件初步优化［J］.云南大学学报(自然科学版)，2008，30(2):198 －201.

［2］Potts JT，Kronenberg HM，Rosenblatt M.Parathyroid hormone:Chemistry，biosynthesis and mode of action［J］.Adv Protein Chem，1982，35:323 －396.

［3］张梅，邬敏辰，金坚.PTH融合蛋白研究进展［J］.生物技术通报，2009，20(3):25 －28.

［4］吴一凡，张双全，高秀玉，等.乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究［J］.南京师大学报(自然科学版)，2002，25(1):89 －93.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(三部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅡA，ⅣC.

［6］张毅，屈贤铭，杨胜利.乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响［J］.生物工程学报，2000，16(4):464－468.