高速逆流色谱法分离望春花蕾中的木兰脂素

杨玉燕，王 晓，孙 瑜，于宗渊

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南250355;2.山东省分析测试中心，山东 济南250014;3.山东省中医药研究院，山东济南250014)

木兰属植物望春花Magnolia biondii Pamp.的干燥花蕾为中药辛夷的主要来源。辛夷为辛温解表类常用中药，有散风寒、通鼻窍的功能，用于风寒头痛、鼻塞流涕、鼻渊等［1］。文献报道，望春花蕾中主要含有挥发油类、木脂素类等成分，具有多种生理活性，包括抗过敏、降压、中枢抑制作用、抗菌、抗病毒、抗衰老等［2］。木兰脂素是其中主要的木脂素类成分之一，其化学结构式见图1，具有较强的抗炎、抗过敏作用［3］，并且对大鼠肾缺血再灌注损伤具有一定的保护作用［4，5］。目前报道的对望春花蕾化学成分的分离主要采用薄层色谱、硅胶柱色谱等传统方法［6，7］。本文报道采用高速逆流色谱(HSCCC)对望春花蕾中的木兰脂素进行分离，方法重现性好，适合于木兰脂素的制备性分离。

图1 木兰脂素的化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器 GS10A型高速逆流色谱仪(北京艾美林科技有限公司);TBP5002型双柱塞恒流泵(上海同田生物技术有限公司);3057－11记录仪(重庆川仪总厂有限公司);8823B－紫外检测器(北京宾达英创新科技有限公司);Waters 600型高效液相色谱仪(美国Waters公司);Varian INOVA－600核磁共振波谱仪(美国Varian公司);Agilent 6320 ion－trap质谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 材料 提取及分离用甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂有限公司)，水为蒸馏水;HPLC分析用甲醇为色谱纯(美国Tedia公司)，水为乐百氏纯净水。

望春花蕾购自陕西省安康市药材公司，经山东省中医药研究院于宗渊研究员鉴定为木兰属植物望春花Magnolia biondii Pamp.的干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 提取及预分离 取望春花蕾粗粉，用95%乙醇加热回流提取2次，提取液回收溶剂得浸膏，拌入适量硅藻土，装柱，先后用石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脱，分别得到石油醚、乙酸乙酯、甲醇洗脱液。取乙酸乙酯洗脱液，回收溶剂得浸膏，备用。

2.2 两相溶剂体系 本实验所用溶剂体系为石油醚－乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(5∶2∶3∶6，v/v)，按比例配置于分液漏斗中，剧烈震荡使充分混合，于室温静置分层。分出上下相，使用前超声脱气15 min，备用。

2.3 分配系数的测定 取少量乙酸乙酯洗脱物置于试管中，加入上下相各3 mL，超声处理，使样品充分溶解，静置分层，取上下相各5 μL，用HPLC进行检测，得上相中目标化合物峰面积为A1，下相中目标化合物峰面积为A2，分配系数K=A1/A2。

2.4 样品溶液的制备 称取乙酸乙酯洗脱物180 mg，加入上下相各4 mL，超声使其完全溶解，用于HSCCC分离。

2.5 HSCCC分离 将已超声脱气的上相(固定相)以20 mL·min－1流速泵入HSCCC螺旋管中，待上相充满整个螺旋管后，缓慢调节主机转速至800 r/min，顺时针旋转，转速稳定后，将下相以2 mL·min－1流速泵入，同时打开紫外检测器，检测波长254 nm，上下相平衡后，将样品溶液注入HSCCC仪，打开记录仪，根据色谱图(见图2)收集流分I，回收溶剂，得到30 mg化合物I。

图2 乙酸乙酯洗脱物的高速逆流色谱图(Ⅰ为接收流分)

2.6 HPLC分析 色谱柱:Inertsil ODS－SP(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温:25 ℃;检测波长:276 nm;流速:1.0 mL·min－1;流动相:甲醇 － 水(60∶40);进样量:10 μL。

乙酸乙酯洗脱物及流分Ⅰ的HPLC图分别见图3和图4。

图3 乙酸乙酯洗脱物的HPLC图谱

图4 流分Ⅰ的HPLC图谱

2.7 结构鉴定 化合物Ⅰ:无色晶体。UV λMeOHmaxnm:204.0，229.0，276.2。ESI－MS m/z:417［M+H］+。1H － NMR(600 MHz，CDCl3)δ:3.11(2H，m，H － 1/H － 5)，3.83，3.87，3.89(each，3H，s，OMe)，3.86(6H，s，OMe)，3.92，4.27(each 2H，m，H －4/H －8);4.75(2H，m，H －2/H －6)，6.67(2H，s，Ar－H)，6.91 － 6.97(3H，m，Ar－ H)。13C － NMR(75 MHz，CDCl3)δ:54.33(C － 1)，54.66(C － 5)，56.16(OMe)，56.42(OMe)，61.14(OMe)，72.05(C －4)，72.13(C －8)，85.90(C－2)，86.25(C －6)，102.85(C －2″/C －6″)，109.34(C －2')，111.15(C －5')，118.50(C －6')，133.60(C － 1')，137.04(C－1″)，137.72(C － 4″)，148.85(C － 3')，149.39(C － 4')，153.65(C －3″/C －5″)。以上数据与文献［7］报道一致，故鉴定为木兰脂素。

3 讨论

高速逆流色谱是一种建立在特殊的流体动力学平衡基础上的液－液分配色谱技术，它不使用固相载体作固定相，克服了传统色谱中固相载体产生的样品不可逆吸附、变性、损失、污染、样品回收率低和峰形拖尾等缺点，现已被广泛应用于天然产物的分离纯化领域［8］。

高速逆流色谱法的应用中，最关键的问题是溶剂系统的选择，不同的溶剂系统有不同的黏度、极性及密度，会对相同的成分产生不同的溶解分配能力进而影响K值和分离效果。本实验根据所分离化合物的特性，观察了目标化合物在三氯甲烷－甲醇－水和石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水等溶剂体系中的分离效果，结果表明，当采用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水为两相溶剂体系时，可实现目标化合物的分离。又对目标化合物在不同比例的石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水体系中的K 值进行了考察，当比例(v/v/v/v)分别为1∶1∶1∶1、5∶2∶3∶6、5∶2∶4∶5 时，K 值分别为 0.3、1.2、2.5，根据色谱理论，利用HSCCC分离样品的必要条件是样品在两相中的分配系数必须在0.5和2.0之间，最好是1;若K≤1，样品会很快随流动相流出，达不到分离效果;若K≥1，样品的出峰时间会延长，形成宽峰，因此最后确定比例为(5∶2∶3∶6，v/v)［9］。

本实验还对流动相的流速进行了考察，当流速较低时，分离时间过长，峰形扩展，流速较大时，分离效果差，最后确定流速为2 mL·min－1，既节约时间和溶剂，又能达到良好的分离效果。

本实验采用HSCCC法对望春花蕾中的木兰脂素进行了分离，与常规柱色谱法相比，该法具有简便、快速、节省溶剂、重现性好的特点，为望春花蕾中木兰脂素的快捷制备提供了一种实用的方法。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:169－170.

［2］杨西晓，庄志铨.辛夷化学成分和药理作用研究进展［J］.中草药，1998，29(7):490 －492.

［3］李小莉，张永忠.木兰脂素抗炎、抗过敏作用的实验研究［J］.中草药，2002，33(11):1014 －1015.

［4］李军辉，王锋，汪年松，等.木兰脂素对肾缺血再灌注损伤大鼠P－选择素表达的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2008，7，9(7):586 －588.

［5］李军辉，王锋，向海燕，等.木兰脂素对肾缺血再灌注损伤大鼠Toll样受体4表达的影响［J］.实用医学杂志，2009，25(4):536 －538.

［6］Lu YH，Gao Y，Wang ZT，et al.A benzofuranoid neolignan from Magnolia biondii pamp［J］.J Chinese Pharmaceutical Sciences，2005，14(3):137 －139.

［7］郭群，方红，苏玮.望春花中的木脂素类化学成分研究［J］.中草药，2004，8，35(8):850 －852.

［8］曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用［M］.北京:化学工业出版社，2005:16－20.

［9］Ito Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum condition for high－speed counter counter chromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1065(2):145－168.