猪细小病毒4型在试验猪的感染进程及在组织中的分布研究

黄 律，龙进学，张宏彪，袁世山，，徐大为，刘婷婷

(1.中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;2.南京农业大学，南京 21009; 3.勃林格殷格翰动物保健,北京 100004）

猪细小病毒4型是2009年由美国科学家发现的一种新型细小病毒，根据基因组分析目前暂将其归入细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属[1]。博卡病毒属最早由牛细小病毒（BPV）和犬微小病毒（CMV）组成。因为一般细小病毒都只有2个开放阅读框（ORFs），而BPV和CMV具有第3个开放阅读框，所以将其单独归入新的属，并取宿主牛和犬的英文单词前2个字母组成BoCa（博卡）病毒的名称。PPV4与BoCa病毒一样具有3个ORFs[1-2]。

近2年来，许多型的猪博卡病毒被不断发现[3-6]，关于PPV4乃至其他型猪博卡病毒的研究目前还都仅停留在流行病学调查和序列分析。人博卡病毒最早于2005 年被发现，目前已经分离到病毒，但还尚未确定其致病性[7]。从目前人博卡病毒的临床病例分析来看，成人博卡病毒IgG的阳性率高达94.2%；人博卡病毒主要感染8岁以下儿童，特别是婴儿；人博卡病毒阳性患儿绝大多数都存在呼吸道以及肠道疾病[8-12]。应用荧光定量PCR对人博卡病毒进行检测发现人博卡病毒存在于人体多种器官，粪便、呼吸道样本以及血清中检出率较高，而定量检测发现通常在血清中博卡病毒含量较高[13-17]。

本研究基于本实验室已经建立优化的Taqman荧光定量PCR技术[18]，对试验猪攻毒PPV4阳性血清，初步了解攻毒后试验猪的症状、血清中病毒DNA拷贝数的变化、各器官病理变化及病毒含量，并且尝试运用阳性血清富集PPV4病毒粒子。

1 材料与方法

1.1 试验猪与阳性病料

试验猪为35日龄未阉割长白断奶仔猪，经严格挑选，选取体重与健康状况一致，PPV4为阴性的试验猪6头。用于动物试验的PPV4阳性病料JS0910，JS0909，JS0918均由本实验室收集、鉴定和保存。试验猪和阳性病料在实验前均确保猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒均为阴性。

1.2 仪器和试剂

主要仪器有Realplex4荧光定量PCR仪（Eppendorf），病料自动研磨器（拓夫机电科技）。DNA提取试剂盒（TIANGENE公司，DP315），荧光定量PCR2×HSTaqMIX（上海睿安生物技术公司），日立HP-900电子显微镜。

1.3 引物和探针的设计合成

根据GenBank 上公布的PPV4全基因组序列（GQ387500、GQ387499）以及本实验室扩增的国内PPV4全基因组序列（GU978964-GU978968,HM031134.1-HM031135.1），选取VP基因中的特异性保守序列设计引物和TaqMan探针，上游引物：5'-TGGTGGTCAAGTATCTGTGCC-3'，下游引物：5'-TTGCTTTTG GATGTCC-TGGT-3'，探针序列：5'-Fam-CCAAACAGCGGC TTCGTGC-Tamara-3'。引物和探针均由上海睿安生物技术公司合成。

1.4 病毒DNA的提取

动物实验结束后解剖试验猪，无菌收集脏器，称重，按1∶1(mL∶ mg)加入PBS进行研磨。组织样品研磨液与血清样品反复冻融3次后，12 000 r/min离心，吸取上清液用于病毒核酸的提取，采用天根公司的病毒DNA提取试剂盒。

1.5 Taqman 荧光定量 PCR 反应

Taqman 荧光定量PCR反应参考本实验室已建立的检测方法[18]进行：Realtime-PCR 总体系为 25μL，其中2×HS Taq 12.5μL，上、游引物(10 μM)各0.5μL，探针(10μM)0.5μL，模板2μL，余下用灭菌ddH2O 补足。反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 S，60 ℃ 40 S并采集荧光强度，进行40个循环。

Taqman 荧光定量PCR扩增曲线：y =-3.478x + 41.26，R2=0.998，扩增效率：0.94。

1.6 动物实验

选择35日龄的未阉割的长白小猪6头，分3组进行动物实验。每组都有一公一母2头试验猪，2组接毒，1组作为阴性对照。重复本实验2次。

选取PPV4阳性病料（血清）（DNA拷贝数约 105/μL）JS0910，JS0909，JS0918各10 mL，混合后12 000 r/min离心15 min取上清，过0.22μm的滤器以除去细菌杂质。接种病料制备好后立即接种实验猪：接种方式为颈部肌肉多点注射，每只试验猪注射PPV4阳性血清5 mL。此后每日观察试验猪的运动、呼吸、采食和饮水，每4天采血一次并测量体温（直肠）。在试验猪血清PPV4阳转开始，分别在攻毒后第8、16、24天和30天分别处死1头猪。收集每只试验猪的血清；之后将试验猪进行剖解，观察各脏器的病理变化，无菌收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、子宫、睾丸、腹部淋巴结、胃、大肠、小肠、气管、脑等组织器官以及肺部灌洗液。按照1∶1（mL∶mg）加入无菌PBS将上述病料进行研磨，取上清，提取DNA后进行Real-timePCR检测，换算出每毫克实验猪各组织中病毒的拷贝数。

1.7 PPV4病毒粒子观察

剖杀PPV4阳性猪时，用大烧杯收集尽可能多的猪血，随后立即使用50 mL离心管5 000 r/min离心10 min，吸取上清-70 ℃保存备用。

取PPV4阳性血清150 mL置于离心管中，平衡后4 ℃ 9 000 g离心30 min，取出离心管肉眼可见离心管底部明显的白色沉淀。小心倒出上清，置于离心管中平衡后4 ℃9 000 g离心30 min，此时离心管底部已经很难看见明显的白色沉淀。吸取上清进行超速离心：将上清置于3个超离专用离心管中，每个约可加38 mL，将液体加满至离心管的上沿约2～3 mm，小心盖上离心管盖子，放入离心机确认无误后关闭离心机舱盖，等待温度降至4 ℃及抽真空完成后160 000 g离心3 h。3 h后肉眼可见离心管底部有少量的沉淀，病毒颗粒在此沉淀中。弃去上清，将3管离心管中的沉淀每管用13 mL的STE缓冲液进行小心吹打，使其彻底溶于缓冲液中，3管合并为1管。配置25%的蔗糖溶液5 mL加于一只新的离心管底，将含病毒粒子的缓冲液小心翼翼加到蔗糖上部，加的时候不可破坏蔗糖溶液，加完液体之后保持蔗糖溶液和缓冲液的分层。将离心管加满至离离心管的上沿约2～3 mm，如首次超离，超离160 000 g 2 h，小心取出离心管，弃去上清，将病毒粒子用1 mLSTE缓冲液悬浮，用电镜放大2 000倍后观察。

2 结果

2.1 试验猪攻毒后的临床变化及剖解病变

试验猪攻毒PPV4后未出现死亡，但攻毒猪相对于阴性对照猪生长速度明显减缓，被毛粗乱。攻毒猪攻毒1 d后即出现大量流涕，咳嗽以及大声喘气等症状，攻毒14 d后咳嗽和喘气症状逐渐好转，20 d后流涕症状也逐渐消除。采食、饮水和排泄均正常。测量体温发现实验猪在攻毒后的第4天体温略升高1～2 ℃，此后趋于正常。

对死亡猪进行剖解发现大部分猪全身淋巴结肿大，特别是肠系膜淋巴结肿大明显（见图1）部分肺脏呈现淤血（见图2），有一头猪还出现肝脏周边组织梗死，其他脏器均未见明显肉眼病变。

图1 肠系膜淋巴结肿大

图2 肺脏部分淤血

2.2 TaqMan荧光PCR对试验猪组织中病毒的检测

对试验猪攻毒的30 d内试验猪体内PPV4 DNA的拷贝数呈明显的消长曲线，大约在接毒后8 d左右病毒的含量达到最高峰，拷贝数约为107/μL，随后病毒的含量逐渐开始下降，到接毒30 d后病毒含量已经下降到104左右（见图3）。阴性对照猪均未检测到PPV4 DNA。

对试验猪进行剖解，收集器官进行组织嗜性研究发现病毒在各个器官均有分布，含量相差在100倍以内，说明PPV4可能存在于多种器官。不同时间处死的PPV4阳性猪各器官中PPV4 DNA拷贝数也略有不同，相差在10倍以内。进一步分析发现前期病毒含量在扁桃体以及肺脏含量较高，后期在肠道、胃部以及泌尿道的含量开始上升，最终肠道和泌尿器官部分的病毒含量最高（见图4）。阴性对照猪各器官均未检测到PPV4 DNA。

2.3 PPV4 病毒粒子电镜观察

用电子显微镜20 000倍观察,观察视野中可见一些类似于细小病毒大小的颗粒，大小约20～30 nm。（见图5）

3 讨论

近几年猪场断奶前仔猪频发顽固性腹泻，特别是2011年春季，由于腹泻导致了大量仔猪的死亡。一些研究报道认为这可能与猪博卡病毒感染有关，从本实验来看猪博卡病毒可能并非其元凶。PPV4感染的试验猪在前期主要表现为呼吸道症状：例如流涕、咳嗽，但在感染2周后这些症状消失，PPV4阳性猪生长速度明显慢于阴性猪，未见类似于人博卡病毒感染所致的肠道症状[8-17]；PPV4阳性猪的饮水、采食以及运动均正常。说明PPV4的致病性可能并非致死性，主要影响猪的生产性能。

对试验猪注射PPV4阳性血清后可产生病毒血症，血清中病毒DNA含量呈现明显的消长曲线，病料接种试验猪8 d后体内的PPV4DNA含量达到高峰。同栏舍的实验猪在8 d后能够感染PPV4说明PPV4也具有传染性，并且传染速度较快，从饲养情况来看很可能通过接触传播以及粪口传播，这一点与人博卡病毒现有的传播途径的推测一致[8-12]。

从试验猪各器官的病理变化来看，主要病变为肺脏淤血以及全身淋巴结肿大，特别是肠系膜淋巴结。当然从实验的条件来看，这也不能断定就一定是由PPV4引起。从试验猪的各组织器官的病毒DNA含量来看，病毒可能首先攻击试验猪的呼吸器官和免疫器官：肺脏和扁桃体，随后攻击肠道以及泌尿器官。这一点与试验猪前期的呼吸道症状吻合，病毒最后对试验猪的肠道以及泌尿道器官的侵害可能也并不是非常强烈，因为试验猪并未出现肠道症状，这可能使得PPV4病毒可以通过肠道以及泌尿道不断向外排毒，导致了其他猪的感染。

本次试验的结果也只是对PPV4的初步研究和探讨，欲知道其确切的致病机理和危害等还需更为科学严格的动物试验，及分离到PPV4,以及采用SPF猪进行动物试验等。

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