综述盐酸克伦特罗的检测方法

韩春晓，张 勇

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866）

“瘦肉精”是一类违禁药物的总称，这类药物实际上既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是我国禁止应用的非法添加物。其实质是肾上腺类神经兴奋剂，主要有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特罗及盐酸多巴胺等7种。现在不法分子添加于畜禽日粮的瘦肉精，是盐酸克伦特罗。盐酸克伦特罗最早作为止喘药用于防治哮喘和支气管痉挛。在20世纪70年代末，美国等发达国家开始了将盐酸克伦特罗用作“营养重分配剂”及“促生长剂”的试验性研究，发现其能够提高胴体瘦肉率，曾被广泛使用[1]。20世纪80年代的时候，我国浙江大学的专家对其进行研究，并应用于畜禽饲料中。此后，由于食用饲喂了瘦肉精的畜禽（及其制品）及内脏后出现了食物中毒事件，而被国家明令禁止添加使用[2]。

我国明令禁止在生猪养殖中添加“瘦肉精”。因此，检测显得尤为重要。以建立一个完整的动物性食品检测系统，保障人们的健康和安全。笔者就盐酸克伦特罗的检测方法作一综述。

1 感官检测

猪屠宰后，可以从肉的颜色和品质上来判断是否含有盐酸克伦特罗，如果肉色泽鲜红，松软，后臀肌饱满突出，脂肪层非常薄，胴体两侧腹股沟脂肪层内毛细血管分布密集，甚至充血，就可怀疑这样的猪肉里含有盐酸克伦特罗[3]。

2 色谱检测

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）具有检测精确度高、假阳性率低的特点，检测盐酸克伦特罗残留的最低检测限为1～15 μg/kg，国内已将高效液相色谱法作为检测盐酸克伦特罗残留的半确证性方法。

赵榕等（2000）运用反相高效液相色谱法测定猪肝中的盐酸克伦特罗，在243 nm的检测波长下，用waters-alliance高效液相色谱系统进行检测，流动相为甲醇和磷酸二氢钠水溶液（35+65），最后再根据保留时间RT值初步定性，扫描光谱进一步确证，根据试样峰高或峰面积与标准峰高或峰面积比较进行定量。当试样取样量为2.0 g时，该法的最低检出浓度为0.25 mg/kg[4]。苗虹等（2001）将样品匀浆后用盐酸溶液超声加热提取，再用异丙醇:乙酸乙醋（40∶60）萃取，有机相浓缩后，用弱阳离子交换柱进行分离用乙醉-氨（98∶2）溶液洗脱，洗脱液以流动相（甲醇和0.01 mol/L KCl溶液以45∶55的比例配合）定容后，用美国Agilent1100高效液相色谱仪系列进行检测，检测限达0.5 μg/kg[5]。蔡玉枝等（2002）运用高效液相色谱法测定猪组织中盐酸克伦特罗残留量，采用了Dianon sil C18 200×4.6 mm的色谱柱，流动相为0.01 mol/L NaH2PO4：甲醇（67∶33），二极管阵列检测器，检测波长为243 nm。采用外标法，以保留时间定性，并以盐酸克伦特罗的特征紫外吸收光谱对照样品的扫描光谱进行确认，然后根据样品峰面积计算盐酸克伦特罗含量[6]。还有人先用C18二氧化硅硅胶柱净化，用HPLC分离，再结合HPLC/ELISA检测、确证[7-9]。高效液相色谱的缺点是检测过程烦琐、检测时间长, 需贵重仪器、难于操作、价格昂贵。

2.2 气象色谱-质谱法

气相色谱-质谱联用法（GC/MS）可以在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性定量分析，且具有较高的灵敏度，是检测盐酸克伦特罗残留的常用的方法之一。气相色谱-质谱联用法可用于饲料、血液、组织中盐酸克伦特罗的分析，检测限为0.5 μg/kg。与高效液相色谱法相比，检测灵敏度更高，假阳性率更低。因此，中国、欧盟及美国等国家将气相色谱-质谱联用法定为检测盐酸克伦特罗的确证性方法。

吴银良等（2006）建立了同时测定动物肝组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺残留量的固相萃取-气相色谱-质谱分析方法，并且盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺的检出限分别为0.30 μg/kg和 1.00 μg/kg[10]。王红（2007）也简化了方法，测定了动物肝脏组织中的盐酸克伦特罗[11]。本方法所需设备昂贵，操作繁琐，分析检测前要对分子上羟基、氨基等极性基团衍生化，难以作为常规方法应用，不能进行现场检测。

3 免疫分析法

3.1 酶联免疫分析

目前，检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析技术是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。该方法检测下限一般为1.0 μg/L（ 尿 样 ）、0.5 μg/kg（ 组织）。使用该法，酶联免疫吸附测定法检测限尿液为0.3～1.0 ng/mL，组织为0.2～1.0 ng/mg。国内外有许多检测试剂盒，但质量不一。酶联免疫吸附测定法作为盐酸克伦特罗残留量的筛选方法具有操作简便、准确、投资小、成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单等优点，适合对活体动物作大批量样品的快速分析；缺点是仍不能实现现场检测，且该法检测结果假阳性率较高，尤其当样品中含有抗生素或磺胺类药物时，会使假阳性率进一步提高[12]。

3.2 放射免疫分析技术

Ropitar和Zimmer首次报道用于β-2肾上腺素能激动剂的放射免疫测定程序和动物组织中盐酸克伦特罗的药理学研究。Delahaut等描述了建立更为特异的放射免疫方法，其中抗盐酸克伦特罗的抗体对其他β-2肾上腺素能激动剂的交叉反应小于10%，最低检测限可达到0.5 ng/g。目前国外已生产出测定盐酸克伦特罗的试剂盒产品，还建立了类似放射免疫分析法的放射受体分析法，这是用受体代替抗体结合盐酸克伦特罗，检测限可达到2.4 ng/g[13]。

放射免疫分析技术虽然具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、易标准化、技术成熟等优点。但仪器价格昂贵和必须使用放射性同位素作为标记物，存在着辐射防护及防止污染的问题，且试剂盒使用时间短，而且每次操作都要做标准曲线，可测量范围相对较窄，难以实现操作及测量的自动化等。

3.3 滴金免疫技术

原理通过盐酸克伦特罗CL（或莱克多巴胺RAC）与CL-BSA（盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白）偶联物（或RAC-BSA）竞争结合抗CL（或RAC）单克隆抗体-胶体金复合物，使试纸上反应线颜色变化，以判定样品中CL（或RAC）的含量。当检样中CL（或RAC）浓度低于最低检测水平时，胶体金中的抗CL（或RAC）单抗-胶体金复合物与T线上的CL-BSA偶联物（或RAC-BSA）结合，T线呈色与C线相近：当检样中CL（或RAC）浓度大于5 ng/mL时，抗CL（或RAC）单抗-胶体金复合物与CL（或RAC）结合，T线显色比C线浅或完全看不到线，且CL（或RAC）浓度越高T线显色越浅，从而作出判定。滴金免疫技术具有简便易行、快速、试剂安全、特异性高、可单份测定、不需要特殊仪器和设备等优点，且金标试剂比酶试剂更稳定，冷冻干燥后可长期保存，便于常规应用。

3.4 时间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是一种新型的超微量的非放射性标记免疫分析技术，它以镧系元素为标记物。时间分辨荧光免疫分析技术集酶标记免疫分析和放射免疫分析等优点于一身，且克服了酶标记物的不稳定性、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰和电化学发光的非直接标记等缺点，降低了非特异性信号，达到了极高的信噪比，大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备方便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、应用范围广泛等优点。因此，越来越受到人们的关注。目前，国内外应用于盐酸克伦特罗检测的时间分辨荧光免疫分析技术的报道还较少，随着技术的越来越成熟，其应用将更广泛。如果研制成检测盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫分析技术试纸条，将可对盐酸克伦特罗的残留进行现场检测[13]。

4 生物传感器技术

将生物技术与微电子技术相结合，利用生物体内抗原、抗体专一性结合而导致电化学变化设计成免疫生物传感器。将CL（或RAC）抗体微型化膜固定于换能器（工作电极）表面，测定时在待测样品溶液中加入已知浓度的酶标激素，CL（或RAC）与标记抗原竞争性地结合电极上的抗体，使经洗涤后的电极与底物溶液接触，标记酶催化底物发生相应的化学变化，转变为电信号输出，输出显示和数据处理系统将信息进行数据处理和输出，直接显示测得CL（或RAC）的含量。

国外已有用生物传感器技术检测CLB残留的资料报道, 如Pizzariello Andrea 应用分子印迹聚合膜（MIP）作为分子识别系统，选择固相基质复合电极（SBMCE）作为换能器，微分脉冲电压电流表（DPV）作为输出显示装置检测牛肝脏中CLB残留，结果此方法特异性强，与其他同类物质交叉反应低，缺点是反应时间较长，灵敏度还有待于提高[14]。目前酶免疫传感器的灵敏度达0.01 μg/kg，而且可在几分钟之内完成检测全过程。目前研制成功的检测盐酸克伦特罗的酶免疫传感器，检 测 限 为 0.3 μg/kg， 可 在 10 min内完成检测全过程，且传感器体积小（15 cm×7 cm×2 cm），便于携带和实现现场检测[15]。生物传感器具有选择性好、响应速度快、样品用量少、操作简易、价格低廉、定量准确，且其结构简单、体积小、携带和使用方便、可以实现连续的在线检测和反复使用等优点。

5 毛细管电泳法

Gausephol和 Blaschke（1998）应用毛细管区带电泳法检测人尿中盐酸克伦特罗的残留，最低检测限达到0.5 μg/L，而且精确度和准确度均符合生物样品中残留物的检测标准[16]。

毛细管区带电泳法分离效率可达几百万理论塔板数，操作简便，快速，所需样品量极少，而且灵活性大，许多分离参数可以调节，但是所需仪器非常昂贵和复杂。

综上所述，酶联免疫吸附测定法、放射免疫分析技术、毛细管区带电泳法、色谱法都不能实现现场快速检测，而且检测设备和检测费用昂贵，生物传感器技术、滴金免疫技术和时间分辨荧光免疫分析技术灵敏，检测快速和方便，是今后研究和开发检测盐酸克伦特罗等残留物的重要方向。

[1]王安如,陈丽仙,宋维平,等. 瘦肉精的“前世今生”及解决方式探索[J].兽医导刊,2011,(4):4-6.

[2]胡红梅,王雅静,齐洪林,等. 我国食品行业“瘦肉精”的现状分析[J].肉类工业,2011(8):51-52.

[3]孙凌志,陈庆勋.“瘦肉精”猪肉的简易检验法[J].中国动物检疫,2002,19(1):43.

[4]赵榕,吴国华,涂晓明. 反相高效液相色谱法测定猪肝中盐酸克伦特罗[J].中国食品卫生杂志,2000,12(2):22-24.

[5]苗虹,赵云峰,赵京玲,等. 测定动物食品中盐酸克伦特罗残留的标准操作程序[C].北京：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，2001.

[6]蔡玉枝,罗晓燕,苏文周.高效液相色谱法测定猪组织中盐酸克伦特罗残留量[J].中国卫生检测杂志,2002,12(2):193-194.

[7]Miyazaki T,Nakajima T, Hashimoto T,et al. Determinati on of clenbuterol in animal tissues, by high performance liquid chromatography[J].J Food Hyg Society of Japan, 1995,36(2):269-273.

[8]HHD Meyer, L Rinke, I Dursch.Residue screening for the β-agonists clenbuterol, aslbutamol and cimaterol in urine using enzyme immunoassay and high-performance liquid chromatography[J]. J chromatogram,1991,564:551-556.

[9]黄宏男,付武胜,林清. 高效液相色谱加酶联免疫吸附法检测鲜冻禽产品中的盐酸克伦特罗[J]. 海峡预防医学杂志,2002,8(1):51-52.

[10]吴银良,李晓薇,刘素英,等. 气象色谱-质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺[J].分析化学,2006,34(8):1083-1086.

[11]王红. 气象色谱-质谱法检测动物肝脏组织中盐酸克伦特罗[J]. 中国卫生检验杂志,2007,17(8):1409-1410.

[12]肖红玉,刘国艳,史贤明. 盐酸克伦特罗的检测方法[J]. 中国饲料,2005(12):31-33.

[13]刘国艳,柴春彦. 动物性产品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）检测方法研究进展[J].动物科学与动物医学,2002,19(4):32-34.

[14]Pizaariello A, St red’anskyM,Stred’ansky S, et al. A solid binging matrix/molecularly imprinted polymer-based sensor system for the determination of clenbuterol in bovine liver using differentialpulse voltammetry [J ]. Sensors and Actuators B, 2001,76:286-294.

[15]刘 国 艳,柴 春 彦,朱 建 国,等. 用于检测盐酸克伦特罗残留的免疫传感器感受器部件的研制[J]. 中国兽医科技,2004,34(6):64.

[16]Gausephol C, Blaschke G.Steroselective determination of clenbuterol residues in human urine by capillary electrophoresis[J].Journal of chromatograp hy,1998,713:443-446.