生脉方主要活性成分配伍对其药代动力学行为的影响

郭文婧，邵 青，张玉峰，范骁辉

(浙江大学药物信息学研究所，浙江杭州 310058)

生脉方源于张元素的《医学启源》，由人参、麦冬、五味子(北)组成，具有益气生津，敛阴止汗之功效，用于心脑血管疾病［1-2］。生脉方主要含有人参皂苷Rb1、Rg1等二醇型、三醇型人参皂苷类及五味子醇甲等木脂素类活性成分［3-6］。以往文献报道的有关人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和五味子醇甲的药代动力学研究，主要是围绕三七总皂苷、五味子药材提取物、生脉制剂及其单体化合物开展的［7-13］，而以生脉方中人参皂苷二醇型、三醇型和木脂素类化合物为研究对象，观测生脉方中不同类型化合物配伍对其药动学行为的影响尚未见报道。中医临床用药的主要形式是方剂，通过配伍组方达到增效、减毒等目的。已有文献大多从方剂药材单煎、合煎提取角度研究中药复方中化学成分迁移、变化来研究方剂配伍的合理性［14］，有文献报道，生脉方合煎后产生的新物质对复方整体疗效是有利的［15］。但是，药物是通过吸收入血才能真正发挥作用。为此，本研究以生脉方中不同类型化合物为研究对象，考察伍用前后药动参数的差异，从药代动力学的视角诠释了配伍的科学性。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1100液相色谱-质谱联用仪配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、电喷雾接口、四极杆质谱，Chemstation色谱数据工作站(美国Agilent公司);SDP121P型离心浓缩仪(美国Thermo公司);Mini span离心机(德国Eppendorf公司);涡旋震荡器(德国IKA公司);分析天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 药品与试剂 人参皂苷 Rg1(批号:101206)、人参皂苷Rb1(批号:101029)和五味子醇甲(批号:100930)标准品均购于上海融禾医药科技发展有限公司;地高辛标准品购于中国药品生物制品检定所，批号:100015-200308。乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，冰乙酸(色谱纯，美国 Tedia公司)，Milli-Q超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，体重为200～300 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号:SCXK(沪)2007-2005。

1.4 标准品储备液、含内标萃取液以及灌胃药液的制备

1.4.1 标准品储备液 取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲标准品适量，精密称定，分别用甲醇溶解配制成质量浓度为1.28 mg·ml-1、1.07 mg·ml-1和 1.02 mg·ml-1的标准品储备液，4℃保存。

1.4.2 含内标的萃取液 精密称取地高辛标准品适量，用正丁醇溶解配制成质量浓度为0.444 mg·ml-1的储备液。临用前用水饱和正丁醇稀释成地高辛质量浓度为35.5 ng·ml-1的萃取液。

1.4.3 灌胃药液 精密称取一定量人参皂苷Rg1、Rb1，分别用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液超声溶解，制成质量浓度为5 mg·ml-1的单体灌胃溶液，另精密称取一定量五味子醇甲，加0.5%羧甲基纤维素钠水溶液碾磨，制成质量浓度为5 mg·ml-1的单体灌胃混悬液，同法制成各单体质量浓度均为5 mg·ml-1的配伍灌胃混悬液。

2 方法与结果

2.1 药动学实验方案 健康SD雄性大鼠24只，给药前禁食12 h，不禁水，给药4 h后自由饮水，12 h后进食。随机分成4个给药组:人参皂苷Rg1单体给药组、人参皂苷Rb1单体给药组、五味子醇甲单体给药组以及三单体配伍给药组。按100 mg·kg-1剂量灌胃给药后，各组分别在 2、5、10、20、40、60 min 及 1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h 经大鼠眼球后静脉丛采静脉血约0.5 ml。人参皂苷Rb1单体给药组和配伍给药组另在24、48和72 h 3个时间点采集血样。分离血清，于-80℃冰箱保存、待测。

2.2 血清样品处理方法 精密量取大鼠血清样品 50μL，加入 milli-Q 超纯水 50μL，涡旋混合10 s，精密加入含内标的萃取液 1.5 ml，1 500 r·min-1涡旋震荡萃取 20 min，12 000 r·min-1离心10 min，精密吸取上清液1.3 ml于2 ml离心管中，40℃离心浓缩干燥3 h以上，残留物加70%甲醇50μL，超声5 min溶解，1 500 r·min-1涡旋 10 min 混匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液待测。

2.3 生物样品分析方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm × 100 mm，3.5 μm)。流动相:0.05%醋酸水溶液(A相)-0.05%醋酸乙腈(B相)，线性洗脱梯度:0 min 20%B，7 min 50%B，15 min 50%B，16 min 80%B，18 min 80%B。流速:0.3 ml·min-1;柱温:40℃;进样量:20μL。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，选择离子监测(SIM)模式:4～11 min负离子扫描，人参皂苷 Rg1的 m/z为 859、人参皂苷 Rb1的m/z为1107、地高辛的 m/z为 779，11 ～15 min正离子扫描，五味子醇甲的m/z为433;源内裂解电压:人参皂苷Rg1、Rb1、五味子醇甲和地高辛分别为200、350、60和300 V。毛细管电压为4 500 V，雾化气温度为350℃，雾化气流速为11 L·min-1，雾化压力为 35 psi。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性试验 取大鼠空白血清液、血清标准品液和配伍给药后血清样品液各50μL分别按2.2项下方法处理(空白血清液萃取改用水饱和的正丁醇液)，按2.3项下方法分析，记录选择离子流图(图1)，大鼠血清中内源性物质均不干扰人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、五味子醇甲和内标物的测定，方法专属性良好。

2.4.2 线性与范围、定量限和检测限 精密量取各标准品储备液适量，加甲醇制成混合标准品储备液，再用甲醇稀释混标储备液制成系列浓度混标溶液，分别精密量取各混标溶液100μL，于2 ml离心管中离心、浓缩、干燥，并加入空白大鼠血清 50μL，超声5min 溶解，按 2.2 项下方法操作，再按2.3项下方法分析。以血清中人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的浓度为横坐标，相应标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标进行线性回归。人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲线性回归方程分别为:Y=0.3137X+0.0157，R2=0.9984;Y=2.0997X+0.0965，R2=0.9929;Y=31.82X+0.4648，R2=0.9983。线性范围分别为:0.0100 ～ 5.12、0.00502 ～2.57 和 0.00239 ～1.22 μg·ml-1。

按信噪比为10∶1计，血清中人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的定量限为:10.0、5.02、2.39 ng·ml-1;按信噪比为3∶1计，血清中人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲的检测限为:5.00、2.51、1.20 ng·ml-1。

2.4.3 回收率试验 分别配制6份低、中、高3种浓度的血清标准品，按2.2项下方法操作，再按2.3项下方法分析，结果见表1。

表1 三种化合物的回收率Table 1 The results of recovery experiment(n=6)

图1 大鼠血清、血清标准品和血清样品液选择离子色谱图Fig.1 LC/MS SIM chromatograms of blank serum sample，serum sample spiked with standard and IS and serum sample

2.4.4 精密度试验 分别配制6份低、中、高3种质量浓度血清标准品，按2.2项下方法操作，再按2.3项下方法分析，结果低、中、高质量浓度日内精密度RSD分别为:人参皂苷Rg14.9%、4.1%、2.4%，人参皂苷 Rb14.1%、2.3%、3.9%，五味子醇甲1.5%、2.9%、5.0%，分别在6 d中配制6份低、中、高3种质量浓度的血清标准品按上述方法处理、分析，结果日间精密度 RSD分别为:人参皂苷 Rg15.2%、6.3%、4.7%，人参皂苷 Rb16.8%、5.9%、3.9%，五味子醇甲13.0%、9.4%、3.6%。

2.4.5 稳定性试验 取中浓度血清标准品，按2.2 项下方法操作，分别于0、3、6、12、18、23 h进样分析，考察室温下生物样品的稳定性，结果人参皂苷Rg1峰面积RSD为6.2%，人参皂苷Rb1峰面积 RSD为4.4%，五味子醇甲峰面积RSD为9.2%。分别取高、低浓度血清样品-80℃保存0、2、3个月，考察生物样本保存3个月内的稳定性，结果人参皂苷Rg1含量RSD为5.0%、6.7%，人参皂苷 Rb1含量 RSD 为10.7%、9.6%，五味子醇甲含量 RSD 为 2.8%、30.6%。

2.4.6 基质效应 取大鼠空白血清50μL，加入 milli-Q 超纯水50μL，涡旋混合 10 s，精密加入水饱和的正丁醇萃取液 1.5 ml，1 500 r·min-1涡旋震荡萃取 20 min，12 000 r·min-1离心10 min，精密吸取上清液1.3 ml于2 ml离心管中，40℃离心浓缩干燥3 h以上，残留物分别加70%甲醇为溶剂的低、中、高3种浓度混标溶液50μL超声溶解，每种浓度平行做6份，按2.3项下方法分析，与对应浓度的混标溶液比较，计算3种化合物在血清中的基质效应分别为:人参皂苷 Rg180.1% ～83.0%、人参皂苷Rb182.9% ～ 88.8%、五味子醇甲 61.2% ～78.9%。

2.5 数据处理与结果 人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲平均血药浓度-时间曲线见图2。单体给药组和配伍给药组血药浓度进行重复测量的方差分析，发现人参皂苷Rg1配伍前后差异有显著性(P=0.035)，人参皂苷Rb1和五味子醇甲配伍前后差异无显著性(P=0.875和0.820)。血药浓度-时间数据采用WinNonLinu6.0药动学软件处理，以非房室模型计算，所得药动学参数见表2～4。单体给药和配伍给药的药动学参数采用t检验分析。本实验设P＜0.05为差异有统计学意义。

图2 人参皂苷Rg1、Rb1和五味子醇甲血药浓度-时间曲线图Fig.2 The blood concentration-time profiles of ginsenosides Rg1，Rb1 and schisandrin

表2 人参皂苷Rg1药动参数Table 2 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rg1(n=6)

表3 人参皂苷Rb1药动参数Table 3 Pharmacokinetic parameters of ginsenoside Rb1(n=6)

表4 五味子醇甲药动参数Table 4 Pharmacokinetic parameters of schisandrin (n=6)

3 讨论

大鼠单体给药和配伍给药后获取的药动学参数表明:配伍给药后人参皂苷Rg1的达峰浓度由(0.476 ±0.238)μg·ml-1上升为(1.95 ±1.43)μg·ml-1，AUC0-∞由(0.523 ± 0.238)μg·h·ml-1上升为(1.91 ±1.32)μg·h·ml-1，清除率由(226311 ± 96819)ml·h-1·kg-1下降为(90650 ±73684)ml·h-1·kg-1，表观分布容积由(317110±154009)ml·kg-1下降为(130967±78306)ml·kg-1，差异均有统计学意义(P＜0.05);而人参皂苷Rb1、五味子醇甲的药动参数伍用前后无明显差异。配伍给药后人参皂苷Rg1的生物利用度较单体给药组有显著提高，表明人参皂苷Rb1和五味子醇甲的存在促进了人参皂苷Rg1的吸收并降低了其消除。有文献报道人参总皂苷给药后人参皂苷Rg1在十二指肠和回肠中的吸收明显好于单体给药［16］，结合本研究结果，验证了人参皂苷Rb1是促进人参皂苷Rg1吸收的重要成分之一。其改善吸收的机制有待进一步深入研究。人参皂苷Rg1、Rb1分属三醇型和二醇型人参皂苷类，其药动特性有很大差异，前者在体内快速吸收和消除，而后者吸收和消除均较慢，其绝对生物利用度均较低。由于同类型皂苷的药动特性相似，提示该类成分的合理伍用，有可能提高三醇型人参皂苷类的生物利用度，从而提高药效。从药代动力学的视角诠释了配伍的科学性，也为有效组分配伍进行新药研发提供科学依据。

［1］ZHANG Sheng，TAN Sheng-yan，LI Sheng-mao，et al(张 胜，谭圣琰，李生茂，等).To trace shengmaisan to its source［J］.Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine(辽宁中医药杂志)，2010，37(10):1918-1919.(in Chinese)

［2］TIAN Geng-chun，WANG Ai-xiang(田更存，王爱香 ). Preparation， pharmacology and clinical application in Shengmai Powders ［J］.Chinese Traditional Patent Medicine(中成药)，2000，22(2):162-165.(in Chinese)

［3］FENG Xue-song，WANG Da-cheng，LU Ya-ru(冯雪松，王大成，刘雅茹).Determination of contents of six active constituents in Shengmaiyin by HPLC［J］.Chemistry and Bioengineering(化学与生物工程)，2008，25(2):76-78.(in Chinese)

［4］ZHANG Jing-wei，WANG Guang-ji，SUN Jian-guo(张 经 纬，王 广 基，孙 建 国).Progress in pharmacodynamics and pharmacokinetics of ginsenoside Rg1［J］.Journal of China Pharmaceutical University(中国药科大学学报)，2007，38(3):283-288.(in Chinese)

［5］XU Hao，GE Ya-ku，DENG Tong-le，et al(许 浩，葛亚 坤，邓 同 乐，等).Protective effect of ginsenoside Rb1against H2O2-induced apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes ［J］. Chinese Pharmacological Bulletin(中国药理学通报药)，2005，21(7):803-806.(in Chinese)

［6］HUANG Xiao-dong，REN Kuang(黄晓东，任旷).Determination of contents of six active constituents in Shengmaiyin by HPLC ［J］.Journal of Jilin Medical College(吉林医药学院学报)，2010，31(1):46-49.(in Chinese)

［7］XU Qing-fang，FANG Xiao-ling，CHEN Dao-feng.Pharmacokinetics and bioavailability of ginsenoside Rb1and Rg1from Panax notoginseng in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2003，84:187-192.

［8］HAN Min，FU Shao，FANG Xiao-ling(韩 旻，傅韶，方 晓 玲).Comparison between the characteristics of absorption and pharmacokinetic behavior of ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1of Panax notoginseng saponins ［J］. Acta Pharmaceutica Sinica(药学学报)，2007，42(8):849-853.(in Chinese)

［10］LIU Hou-fu，YANG Jun-ling，DU Feifei，et al.Absorption and disposition of ginsenosides after oral administration of Panax notoginseng extract to rats［J］.Drug Metabolism and Disposition，2009，37:2290-2298.

［11］FENG Liang，WANG Ling，HU Chang-jiang，et al.Pharmacokinetics，tissue distribution，metabo-lism，and excretion of ginsenoside Rg1in rats［J］.Archives of Pharmacal Research，2010，33(12):1975-1984.

［12］WANG Sheng-chun，ZHAO Hui-ping，HUANG PU Meng-jun，et al(王胜春，赵惠萍，皇甫孟军，等).Pharmacokinetic effect of the combination of Fructus Schisandrae and Radix Salvia M iltiorrhizae on schizandrol A and schizandrin B［J］.Chinese Traditional Patent Medicine(中成药)，2004，26(12):987-991.(in Chinese)

［13］ZHAO Huai-qing，ZHAO Rong-shu，ZHANG Chao，et al(赵怀清，赵荣淑，张 超，等).Pharmacokinetic studies of schizandrin in rat plasma［J］.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(药物分析杂志)，2006，26(5):605-608.(in Chinese)

［14］YAN Yong-qing(严永清).Synergism factors of material base in compound prescription of Traditional Chinese medicine［J］.World Science and Technology(世界科学技术)，2001，3(2):17-20(in Chinese).

［15］XIA Yun，LI Zhi-ming，ZHU Dan-ni，et al(夏云，李志明，朱丹妮，等).A research on chemical dynamic changes and drug efficacy of SMS compound prescription chemical researches on SMS prescription ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica(中国中药杂志)，1998，23(4):230-231.(in Chinese).

［16］LV Tian，SUN Jian-guo，LV Hua，et al(吕 天，孙建国，吕 华，等).Study on absorption of ginsenoside Rg1using rat ansa intestinal model［J］.Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics(中国临床药理学与治疗学)，2006，11(7):780-783.(in Chinese)