支链氨基酸增强小鼠的游泳能力对其血氨和5-羟色胺变化的研究

夏 志，汪清祥，彭 勇，徐 飞

支链氨基酸增强小鼠的游泳能力对其血氨和5-羟色胺变化的研究

*夏 志1,2，汪清祥1，彭 勇1，徐 飞3

（1.井冈山大学体育学院，江西，吉安 343009；2.北京体育大学研究生院，北京 100084；3.浙江工业大学体军部体育科学研究室，浙江，杭州 310023）

探讨支链氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAAs）对训练小鼠抗疲劳运动能力的影响。50只小鼠随机分为实验组（B1、B2、B3、B4）和对照组（C）。实验组分别灌胃补充BCAAs 0.45、1.25、3.75和10g/kg.d，对照组灌胃生理盐水。各组小鼠5周递增负荷游泳训练后进行力竭游泳并取材。观察BCAAs对小鼠脑组织5-羟色胺（5-HT）、血氨（PA）和力竭游泳时间的影响。实验组小鼠血氨含量升高，脑组织匀浆中5-HT含量下降，但力竭运动游泳时间均显著延长。结果血氨浓度随剂量的增加而增大，C与B1组相比血氨水平无显著性差异，但明显低于B2、B3、B4组（< 0.01）；C组小鼠5-羟色胺浓度显著高于实验组（< 0.01），实验组间随着补充剂量的增大5-羟色胺浓度减小；实验组小鼠力竭游泳能力明显强于对照组（< 0.01）。实验组间，B2、B3组小鼠力竭时间明显长于B1组（分别为< 0.05，< 0.01），B4组力竭时间与B1、B2、B3组相比则下降。BCAAs能够对抗运动性疲劳的发生发展，增强运动能力，但具有量效关系。

支链氨基酸；小鼠；力竭游泳； 5-羟色胺；血氨

支链氨基酸(Branched-chain amino acids, BCAAs)的抗中枢疲劳效应二十多年来一直存在争议。Newsholme等[1]的色氨酸-5-羟色胺-中枢疲劳学说提示BCAAs可通过竞争性抑制5-羟色胺(Serotonin,5-HT)的合成而起到增强运动能力的作用。但部分学者[2-4]则提出，由于BCAAs代谢会生成氨，因此反而会加速疲劳的发生发展。基于此，本研究拟通过探讨补充不同剂量BCAASs对5-HT、血氨(Plasma ammonia, PA)浓度和力竭运动能力的影响而为相关促力运动营养补剂的开发提供实验佐证。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本实验采用5周龄雄性[5]昆明小鼠50只，体重(29.27 ± 0.47)g。于室温(22 ± 1.5) ℃、湿度(50 ± 4) %的环境下置于标准笼舍饲养，室内照明控制在12 h/12 h光暗周期。采用标准标准啮齿类动物干燥饲料饲喂，自由饮水。适应性饲养1周后，所有小鼠被随机分为对照组（C组）和实验组（B1、B2、B3、B4组），每组10只。

1.2 给药

用生理盐水将BCAAs（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸含量比例为1：1：1）[6]配制成所需浓度溶液，B1、B2、B3和B4组小鼠每日采用圆头针分别以0.45 g/kg、1.25 g/kg、3.75 g/kg和10 g/kg剂量灌胃给药，灌胃容积0.2 mL/10g。C组直接灌胃等量生理盐水。

1.3 运动方案

小鼠在塑料贮存箱内(66.6 cm×49.5 cm×42 cm)进行为期5周的游泳训练。水温保持在(30 ± 0.5) ℃，水深35 cm以上，使小鼠无法通过将尾尖支撑于箱底而休息。训练和力竭游泳期间均有专人盯守，避免小鼠在游泳过程中出现漂浮等消极活动。根据啮齿动物生活习性，游泳安排在晚7点至12点进行。为了使小鼠适应运动方式与强度，游泳时间由20 min开始，每2天递增5 min，共计训练5周，故至末次训练时游泳时间为90 min。于第五周的周六进行无负重力竭游泳运动测试，力竭标准参照Thomas报道的方法[7]：运动明显失去协调，小鼠在水中不定向乱窜，沉入水中后超过10 s仍不能自主浮出，未达到10 s亦判断为力竭。

1.4 取材与样本置备

力竭后即刻迅速取血、断髓处死取全脑。血液装于无菌真空EDTA管内，轻微摇匀后置-20℃冰箱冷藏，24 h内测定；脑组织经液氮速冻后置-80℃冰箱内冷藏，48 h内测定。测定5-HT时称取脑组织0.1 g，加入冰冷的0.9%氯化钠水溶液冲洗除去血液，加入3 mL预冷的酸性正丁醇，匀浆器充分研磨，倒入离心管内再按重量补足正丁醇量。然后以3000 rpm/min离心10 min，取上清液保存。

1.5 主要试剂及仪器

血氨试剂盒购自北京柏定生物工程有限公司、5-羟色胺硫酸肌酐购自Sigma公司。主要仪器：美国RT-1904C半自动生化分析仪、日本岛津RF540型荧光分光光度计。

1.6 指标检测

谷氨酸脱氢酶偶联法测定PA。荧光法测定脑组织5-HT。

1.7 数据统计

数据用`x ± s表示，采用双因素方差分析对数据进行统计处理，组间多重比较采用LSD法，SPSS13.0进行统计学分析计算，显著性水平置于< 0.05。

2 结果

2.1 补充BCAAs对小鼠PA和脑5-HT水平的影响

B1与C组相比PA水平无显著性差异，B2、B3、B4组浓度则明显高于C组(< 0.01)。实验组组间比较发现，随BCAAs补充剂量的增大，PA浓度升高，其中10 g/kg剂量补充时PA水平远高于其他各组(< 0.01)，与C组相比增加百分率达到89.7%（如表1）。

表1 支链氨基酸对训练小鼠血氨含量的影响(`x ± s)

* compare with group C< 0.01; # compare with group B1< 0.01;▲ compare with group B4< 0.01

C组小鼠5-HT浓度显著高于各实验组，且实验组间比较显示随补充剂量的增大，5-HT浓度下降幅度增大。10 g/kg剂量可使5-HT含量下降41.3%（如表2）。

表2 支链氨基酸对训练小鼠脑组织5-羟色胺含量的影响(`x ± s)

* compare with group C< 0.01; # compare with group B1< 0.01; ▲ compare with group B4< 0.01

2.2 补充BCAAs对游泳力竭时间的影响

BCAAs补充对小鼠力竭游泳时间影响较大。实验组小鼠力竭游泳能力明显强于对照组C组(< 0.01)。此外，实验组各组间比较发现B2、B3组小鼠力竭时间明显长于B1组（分别为< 0.05，< 0.01）。补充剂量分别为0.45 g/kg、1.25 g/kg、3.75 g/kg时，随着剂量的增加，力竭游泳时间也延长，以3.75 g/kg剂量补充时，增加百分比达48.9%，然而以10 mg/kg进行补充时，力竭时间开始缩短，增加百分比随之下降，但力竭时间仍显著长于对照组C组（< 0.01）（如表3）。

表3 训练小鼠的力竭游泳时间(`x ± s)

* compare with group C< 0.01; # compare with group B1< 0.05;▲ compare with group B1< 0.01

3 分析与讨论

3.1 BCAAs对耐力训练小鼠PA浓度影响分析

PA水平的变化可以反映长时间耐力运动中单胺类神经递质引起的中枢性疲劳，为我们借助血液中代谢参数探索运动性中枢疲劳提供了理论依据。就BCAAs对PA的影响而言，目前报道较少，Van Hall等[2]早期的研究提出补服BCAAs会导致血液中PA浓度升高。当其穿越血脑屏障后，直接影响大脑的能量代谢及神经元细胞膜的正常生理功能，并干扰中枢内神经递质的代谢，使纹状体多巴胺减少，下丘脑5-HT/多巴胺比值升高，导致中枢神经系统不同部位功能紊乱，出现动作失调、僵硬等运动能力下降的表现，所以导致运动性疲劳的提早发生。Watson等[9]后来的人体实验也表明，BCAAs补充导致PA浓度显著升高。但本研究结果发现：B1组与C组小鼠相比，PA浓度虽升高，却并无显著性差异，该组小鼠力竭游泳能力明显增强(< 0.01)；B2、B3组的PA浓度与C组小鼠相比有明显升高(< 0.01)，而力竭时间也明显要长，这是一个非常有趣的现象。究其机理，推测可能是因为BCAAs在运动过程中代谢生成氨的能力不足以对抗其竞争性抑制5-HT合成的能力，所以虽然其分解产生的PA入脑后会导致5-HT/多巴胺比值的升高，最后仍因为BCAAs在抑制5-HT生成方面更占优势而表现为游泳时间的延长即延缓了运动性中枢疲劳的发生和发展；B4组小鼠的PA浓度为各组间最高，增幅高达89.7%，其力竭时间为实验组内最短，但仍高于C组，说明以10 g/kg剂量补充时由于PA浓度大幅增加，其促疲劳作用相对BCAAs的抗疲劳作用占优势，从而最终表现出力竭游泳时间相对缩短，虽然如此，仍表现出一定的促力作用。

3.2 BCAAs对耐力训练小鼠全脑5-HT浓度影响分析

根据Newsholme等的中枢疲劳理论学说，5-HT的生成与积聚是导致中枢疲劳发生发展的关键因素。早期Welsh[10]等的实验发现，与对照组相比，大鼠补充BCAAs进行跑台运动120 min后中脑5-HT浓度明显降低。其后，Gomez-Merino等[11]利用微透析技术发现BCAAs补充可以使运动中海马5-HT的释放量维持于安静水平，但由于大鼠运动时间固定为2 h，所以也有人怀疑其研究并不能比较出BCAAs补充对运动能力的影响。在相关实验研究中，较为经典的是Yamamoto[12]的一项研究，实验采用遗传性白蛋白缺乏大鼠作为研究对象，因为此种大鼠先天性白蛋白缺乏，从而排除了内源性白蛋白对血浆Trp浓度及动力学的控制。该实验发现，与对照组相比，注射BCAAs可显著性延长运动至力竭的时间，并且5-HT的分泌量显著降低。这一研究为BCAAs作为促力手段提供了一定线索。本实验结果显示，与C组相比，实验组小鼠在进行力竭运动后，脑组织5-HT含量明显偏低 (< 0.01)，与Yamamoto的研究结果一致。提示，外源性补充BCAAs能够减少5-HT合成与聚集，从而可以延缓疲劳的发生，表现为力竭游泳时间的延长。

3.3 BCAAs对耐力训练小鼠力竭游泳能力影响分析

有关BCAAs的营养促力作用，目前研究结果尚不明确，Blomstrand[13]曾将补充BCAAs应用于长时间运动项目如马拉松、越野滑雪及足球比赛等作为促力手段，发现在赛前、运动中补充BCAAs可显著提高部分选手的运动成绩。Mittleman等[14]的人体实验则表明，补充BCAAs被试在热环境下的力竭运动时间明显延长。而Madsen等[15]和Davis等[16]的实验却都显示，额外补充BCAAs并没有达到减轻疲劳的效果。分析上述各项研究结果之间的差异，关键还是在补充剂量的差异。

从PA的角度来说，补充BCAAs越多则PA生成越多，从而有可能影响BCAAs促力效应的表现。其次，人体实验由于取材的限制而不能进行中枢指标的检测，只能通过心理学方法来判断是否有中枢疲劳发生，这可能也是导致研究差异的原因之一。此外必需注意的是，被试的运动水平实际上也是影响研究结果的重要潜在因素，因为训练水平越高则成绩提升的空间越小，如果不考虑这方面因素则也可能得出不同结论。本研究结果表明，以0.45 g/kg、1.25 g/kg和3.75 g/kg剂量补充BCAAs 5周之后，小鼠力竭游泳运动能力不同幅度的提高，且在0.45 ~3.75g /kg范围内随着补充剂量的增加小鼠游泳时间延长。以10g/kg剂量补充虽时间增幅减小，这一现象可能与PA的相对增多有关，但其力竭游泳时间仍显著长于对照组。提示补充BCAAs有增强小鼠运动能力的作用，但具有量效关系。

[1] Newsholme E A, Acworth I N, Blomstrand E. Amino acids, brain neurotransmitters and a functional link between muscle and brain that is important in sustained exercise. In: Benzi G, editor. Advances in myochemistry[M]. London: John Libbey, 1987: 127-133.

[2] Van Hall G, Raaymakers J S, Saris W H, et al. Ingestion brainched-chain amino acids and tryptophan during sustaine exercise in man:failure to affect performance[J]. J Physiol, 1995, 486 (3): 789-794.

[3] MacLean D A, Graham T E. Branched-chain amino acid supplementation augments plasma ammonia responses during exercise in humans[J]. J Appl Physiol, 1993, 74 (6): 2711-2717.

[4] MacLean D A, Graham T E, Saltin B. Branched-chain amino acids augment ammonia metabolism while attenuating protein breakdown during exercise[J]. Am J Physiol, 1994, 267 (6 Pt 1): E1010-E1022.

[5] Koizumi T, Hayakawa J, Nikaido H. Blood ammonia concentration in mice: normal reference values and changes during growth[J]. Lab Anim Sci, 1990, 40 (3): 308-311.

[6] Torigoe K, Potter P E, Katz D P. Branched-chain amino acid-induced hippocampal norepinephrine release is antagonized by picrotoxin: evidence for a central mode of action[J].Brain Res Bull, 1999, 49 (4): 281-4.

[7] Thomas D P, Marshall K I. EEffects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures[J]. Int J Sports Med, 1988, 9 (4): 257-260.

[8] Leibowitz S F, Diaz S, Tempel D. Norepinephrine in the paraventricular nucleus stimulates corticosterone release[J]. Brain Res, 1989, 496 (1-2): 219-227.

[9] Watson P, Shirreffs S M, Maughan R J. The effect of acute branched-chain amino acid supplementation on prolonged exercise capacity in a warm environment[J]. Eur J Appl Physiol, 2004, 93 (3): 306-314.

[10] Welsh R S, Waskovich M, Alderson N L, et al. Carbohydrate and branched-chain amino acids feedings suppress brain 5-HT during prolonged exercise[J]. Med Sci Sports Exerc, 1997, 29 (5): S192.

[11] Gomez-Merino D, Bequet F, Berthelot M, et al. Evidence that the branched-chain amino acid L-valine prevents exercise-induced release of 5-HT in rat hippocampus[J]. Int J Sports Med, 2001, 22 (5): 317-322.

[12] Yamamoto T, Newsholme E A. Diminished central fatigue by inhibition of the L-system transporter for the uptake of tryptophan[J]. Brain Res Bull, 2000, 52 (1): 35-38.

[13] Blomstrand E, Hassmen P, Ekblom B, et al. Administration of branched-chain amino acids during sustained exercise:effects on performance and on plasma concentration of some amino acids[J]. Eur J Appl Physiol, 1991, 63 (2): 83-88.

[14] Mittleman K D, Ricci M R, Bailey S P. Branched-chain amino acids prolong exercise during heat stress in men and women[J]. Med Sci Sports Exerc, 1998, 30(1):83-91.

[15] Madsen K, Maclean D A, Kiens B, et al. Effects of glucose, glucose plus branched-chain amino acids, or placebo on bike performance over 100 km[J]. J Appl Physiol, 1996, 81 (6): 2644-2650.

[16] Davis J M, Welsh R S, De Volve K L, et al. Effects of branched-chain amino acids and carbohydrate on fatigue during intermittent, high-intensity running[J]. Int J Sports Med, 1999, 20 (5): 309-314.

BRANCHED-CHAIN AMINO ACIDS SUPPLEMENTATION ENHANCES SWIMMING PERFORMANCE OF TRAINED MICE: EVIDENCE FROM CHANGES OF PLASMA AMMONIA AND SEROTONIN

*XIA Zhi1,2，WANG Qing-xiang1，PENG Yong1，XU Fei3

（1.Institute of P.E., Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2.Institute of Postgraduate, Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 3.Institute of Sports Science Research, Department of P.E. & Military, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang 310023, China）

: To determine the effects of branched chain amino acids (BCAAs) on sport ability in trained mice.:KM mice were divided into experimental groups (group B1, B2, B3, B4) and control group (group C) randomly. The experimental groups respectively received BCAAs supplementation of 0.15g/kg.d, 1.25g/kg.d, 3.75g/kg.d and 10g/kg.d by stomach intubations, and control group were fed with equivalent physiological saline solution. Effects of BCAAs on plasma ammonia (PA) and serotonin (5-HT) contents of mice brain tissue and the exhaustive swimming time were examined.: As for PA, the content increased along with the growing dosage of BCAAs supplementation, but there was no significant difference between group C and B1, but this significant difference existed when compared with B2, B3 and B4 (< 0.01). The concentration of 5-HT in group C were higher than experimental group (< 0.01), and decreased along with the growing of BCAAs supplementation. The exhaustive swimming time of experimental groups were longer than control group (< 0.01). Compared within experimental groups, the exhaustive swimming time of mice for group B2 (< 0.05) and B3 (< 0.01) was longer than group B1 and was the shortest for group B4.: BCAAs supplementation can counter against the onset and development of exercise-induced fatigue and sport ability, but the effect was dosage-dependent.

branched chain amino acids (BCAAs); mice; exhaustive swimming; serotonin (5-HT); plasma ammonia (PA)

Q463

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.023

1674-8085(2012)02-0090-04

2012-01-15；

2012-02-15

井冈山大学科研计划项目(JZ10035)

*夏 志(1982-)，男，湖北鹤峰人，讲师，博士生，主要从事运动性疲劳及骨骼肌机能研究(E-mail: xiazhi@jgsu.edu.cn);

汪清祥(1969-)，男，江西永新人，讲师，主要从事体育教育训练学研究(E-mail: wangqingxiang19@sina.com);

彭 勇(1954-)，男，江西永新人，教授，主要从事体育教育训练学研究(E-mail: pengyong@jgsu.edu.cn);

徐 飞(1981-)，男，重庆人，讲师，博士，主要从事低氧训练及运动分子生物学研究(E-mail: yangt1193@163.com).