端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究

张愈延

端粒酶转染防治角膜内皮失代偿的研究

张愈延1,2

（1.井冈山大学医学院，江西，吉安 343009；2. 井冈山大学附属医院，江西，吉安 343000）

评价端粒酶转染对角膜内皮细胞形态和功能的影响。将体外培养的猫角膜内皮细胞随机分为3组，兔端粒酶基因转染组、正常对照组和表皮生长因子组。培养30代后观察传代细胞形态和细胞周期各时相细胞比例的变化，检测端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达。兔端粒酶基因转染组细胞数目较正常对照组和表皮生长因子组增多，伸展贴壁能力增强，表型正常，G2~M期和S期细胞比例显著增加，端粒酶逆转录酶蛋白和Ⅳ型胶原的表达也较正常对照组增多。兔端粒酶转染可以促进猫角膜内皮细胞增殖且表型正常，可以增强其伸展粘附能力和分泌功能，有利于防治角膜内皮失代偿。

端粒酶；基因转染；角膜内皮细胞；增殖

角膜内皮细胞结构和功能的正常是维持角膜透明性的重要前提。在婴幼儿，角膜内皮细胞可以进行有丝分裂，但在成年后不再进行有丝分裂。当内皮细胞损伤后，其缺损区由邻近的内皮细胞增大、扩展和移行滑动来填补覆盖。所以，随着年龄的增长，角膜内皮细胞的密度逐渐下降。当角膜内皮细胞的密度由于各种病损的作用低于某一临界值时，发生角膜水肿和大泡性角膜病变，称为角膜内皮失代偿。如何恢复成年人角膜内皮细胞的有丝分裂能力以及防治角膜内皮失代偿一直是眼科界的研究热点。本研究依据细胞衰老的端粒假说，用兔端粒酶逆转录酶（rTERT）转染猫角膜内皮细胞为实验模型，探讨其对猫角膜内皮细胞形态和功能的影响，以期恢复猫角膜内皮细胞的有丝分裂能力，为进一步防治角膜内皮失代偿奠定基础。

1 材料与方法

1.1 pIRES2-增强性绿色荧光蛋白（EGFP）-rTERT正义荧光真核表达载体的构建及鉴定

仿照文献[1]所采用pIRES2-EGFP-人类端粒酶逆转录酶（hTERT）正义荧光真核表达载体的构建方法和步骤操作，采用NotⅠ酶切法进行连接方向性的鉴定。

1.2 猫角膜内皮细胞实验室培养

取健康家猫新鲜眼球数只，用无菌PBS溶液冲洗干净后，抗生素D-Hanks液(含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)浸泡30 min，按照参考文献[2]所采用的方法进行实验室培养，制成细胞悬液，调整细胞密度约100×106·L-1，每孔200 μL接种于24孔培养板中。培养板每6孔为1组，分为3组，分别命名为端粒酶基因转染组（A组）、正常对照组（B组）和表皮生长因子组（C组）；A组拟进一步转染rTERT，B组不作任何处理，C组基础培养液中加入表皮生长因子，放在37℃、5%CO2培养箱中进行饱和湿度培养。原代猫角膜内皮细胞培养36 h后换液1次。以后每2 d换液1次，备用。

1.3 rTERT导入原代猫角膜内皮细胞

采用Lipofectin试剂盒，通过脂质体法，按照试剂盒操作说明和文献[3]所采用的hTERT转染原代培养的人类胚胎成纤维细胞的操作方法，在实验室条件下将rTERT转染导入A组原代猫角膜内皮细胞中，原培养条件下继续体外培养。

1.4 细胞周期的流式细胞仪检测

将转染rTERT猫角膜内皮细胞（A组）继续培养36 h后，按照参考文献[4]所介绍的方法处理后，进行流式细胞仪检测并分析细胞生长周期。同期、同条件下培养的B组和C组猫角膜内皮细胞也按照相同操作方法进行流式细胞仪检测分析细胞生长周期。

1.5 细胞形态学观察

将培养至30代A组、B组和C组角膜内皮细胞分别放在倒置相差显微镜下观察形态变化。

1.6 猫角膜内皮细胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型胶原的表达

采用蛋白印迹法，对培养至30代A组、B组和C组角膜内皮细胞，按照文献[5]所述的详细步骤操作，进行猫角膜内皮细胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型胶原的表达量的检测。当正常猫角膜内皮细胞、猫角膜内皮细胞-rTERT及猫角膜内皮细胞-EGFP达90 %融合时，再参照文献[3]进行操作，扩增后分别命名为猫角膜内皮细胞-rTERT和猫角膜内皮细胞-EGFP。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 细胞形态变化

倒置相差显微镜下发现，A组猫角膜内皮细胞数量明显增多，易于聚集成群，贴壁范围较广，细胞较大呈不规则形状，部分呈六边形，周边细胞可见伸出伪足；B组猫角膜内皮细胞较小，贴壁细胞较少，多呈圆形或椭圆形团状；C组猫角膜内皮细胞也见增多，但细胞多呈悬浮状态，贴壁较少，伪足不明显。随着培养时间延长，A组、C组细胞数量较B组增多更为明显。

2.2 细胞生长周期变化

经单因素方差分析，与B组相比，A组、C组G0~G1期(G0：静止期；G1：DNA合成准备期)细胞比例显著下降（< 0.05），三组间两两比较具有统计学意义（< 0.05）；与B组相比，A组、C组G2~M期(G2：DNA合成后期；M期：有丝分裂期)细胞比例显著提高(< 0.05)，但A组和C组G2~M期细胞比例的变化(> 0.05)在α = 0.05检验水准上无统计学意义；与B组相比，A组、C组S期(S期：DNA合成期) 细胞比例显著提高(< 0.05)，三组间两两比较具有统计学意义（< 0.05）。

表1 兔端粒酶基因转染和表皮生长因子应用对猫角膜内皮细胞周期各时相细胞比例的影响

a> 0.05，A组、C组比较（单因素方差分析, SNK-检验）

2.3 TERT蛋白和Ⅳ型胶原表达量的变化

蛋白印迹法检测发现，猫角膜内皮细胞、猫角膜内皮细胞-rTERT、猫角膜内皮细胞-EGFP中均有TERT蛋白表达，但猫角膜内皮-rTERT细胞中TERT蛋白表达量明显高于猫角膜内皮细胞和猫角膜内皮细胞-EGFP，而且部分为rTERT蛋白，说明兔端粒酶逆转录酶已经成功转入猫角膜内皮细胞，并且开始有兔端粒酶逆转录酶蛋白的表达。另外，猫角膜内皮-rTERT细胞Ⅳ型胶原表达量较正常猫角膜内皮细胞及猫角膜内皮细胞-EGFP也显著增加。

3 讨论

3.1 端粒酶结构与猫角膜内皮细胞的研究

端粒酶是一种特殊的核糖核酸蛋白质聚合物，是依赖RNA的DNA聚合酶。Gryfe R等于1997年提出了细胞衰老的端粒假说，即细胞衰老和永生假说，这种假说认为细胞衰老是端粒复制问题得不到补偿的结果，端粒的缩短是正常体细胞老化的有丝分裂钟，当端粒长度缩短到一定程度，即所谓的末端限制片段（TRF）的长度为5~7 kb时，就有信号指令细胞退出细胞周期，有丝分裂便不可逆地被阻断在细胞周期的G1期和G2PM期之间的某个时期，这时的细胞便进入了老化期，随后死亡[6]。近年来，细胞衰老的端粒假说得到越来越多的研究结果所支持，也获得越来越多的科学家的认可和肯定。许多研究表明体外培养细胞的老化加速与细胞染色体末端的端粒随细胞分裂次数的增多而逐步缩短有关。例如有证据表明全世界第一只克隆羊多莉的过早衰老和它的细胞中染色体端粒比正常的同龄山羊的端粒短20%有关，所以有人称多莉是“披着小羊皮的老羊”[7]。Shiels PG等研究[8]表明，生殖细胞之所以具有较强的有丝分裂能力，在于其端粒酶活性处于高活性状态，其端粒长度长期维持在一个恒定的高水平；各种干细胞和婴幼儿的角膜内皮细胞，和某些动物细胞（例如兔角膜内皮细胞）之所以保持潜在的有丝分裂能力，在于其端粒酶处于弱活性状态；而绝大多数人类体细胞的端粒酶处于失活状态，无法进行有丝分裂，损伤后无法增殖再生，例如成年人角膜内皮细胞就是如此。目前眼科界普遍认为，猫角膜内皮细胞和成年人角膜内皮细胞具有相同的增殖特性，失去了有丝分裂能力。由于正常成人角膜内皮细胞不容易获取，影响因素较多，实验条件不容易掌控，而猫角膜内皮细胞容易获取，体外培养条件成熟，实验容易掌控，所以本次研究动物模型选用猫角膜内皮细胞作为实验对象，间接探讨端粒酶基因转染对成人角膜内皮细胞结构和功能的影响。端粒酶是由三个部分构成的，即端粒酶逆转录酶（TERT），端粒酶RNA模板（TR）和端粒酶相关蛋白[9]。由于目前对TERT研究得较为清楚，它是端粒酶蛋白的催化亚单位，有相关研究领域成功经验可以借鉴，实验试剂购买比较容易，所以本次研究选用TERT作为转染基因，通过将兔端粒酶逆转录酶（rTERT）转染至端粒酶失活细胞——猫角膜内皮细胞中，以期恢复或部分恢复猫角膜内皮细胞的有丝分裂能力，构建“永生化”的猫角膜内皮细胞，为角膜组织工程提供种子细胞，并为进一步防治角膜内皮失代偿奠定基础。

3.2 端粒酶基因转染与角膜内皮细胞的生长

本研究结果显示，猫角膜内皮-TERT细胞中TERT蛋白表达明显高于猫角膜内皮细胞和猫角膜内皮-EGFP，而且部分为rTERT蛋白，表明rTERT已成功转染至猫角膜内皮细胞，并且开始有rTERT蛋白的表达。猫角膜内皮细胞经过兔端粒酶逆转录酶转染后，TERT蛋白表达量和Ⅳ型胶原表达量比正常猫角膜内皮细胞和猫角膜内皮细胞-EGFP增加，说明外源性端粒酶基因转入后，猫角膜内皮细胞蛋白表达功能正常，端粒酶失活抑制状态可能得到了某种程度上的解除，预示端粒酶活性在体外培养条件下可以在一定程度上进行掌控，适合于基因工程研究对目的基因的要求。Ⅳ型胶原是角膜后弹力层的主要成分，主要由角膜内皮细胞分泌，有利于角膜内皮细胞的粘附和维持其固有的六边形结构，说明兔端粒酶逆转录酶导入后，猫角膜内皮细胞分泌功能增强，有利于其伸展和粘附，缩短损伤后的修复时间，改善修复质量，为防止角膜失代偿奠定基础。本研究细胞周期流式细胞仪检测结果表明，转染兔端粒酶基因后，猫角膜内皮S期和G2~M期细胞比例明显增高，而G0~G1期细胞比例明显下降，和正常对照组的差别有统计学意义。尤其是S期细胞比例，相对于表皮生长因子组细胞也具有显著性差异，说明转染兔端粒酶逆转录酶相对于表皮生长因子来说，可以促使更多的细胞进入S期，具有更强的促进细胞进行有丝分裂的能力，可以延长猫角膜内皮细胞的生命周期，传代数增多，延长猫角膜内皮细胞的寿命，阻断角膜内皮失代偿的发病机制，防治角膜内皮失代偿。细胞形态学观察结果也说明转染组猫角膜内皮细胞体外相同培养条件下具有良好的增殖能力，数量明显比正常对照组和表皮生长因子组增多，细胞贴壁能力增强，易于形成伪足，具有应有的形变能力和伸展粘附能力。而且随着传代数的增多，观察至30代后表型结构正常，倒置相差显微镜下未发生明显突变征象，表明兔端粒酶逆转录酶转染联合实验室培养可以使猫角膜内皮细胞建立“永生化”细胞系，和端粒酶基因转染胰岛素分泌细胞研究结果类似[10]，符合角膜组织工程对种子细胞的要求，具有良好的组织工程应用前景。总之，流式细胞仪和分子生物学检测以及形态学观察结果均表明兔端粒酶逆转录酶导入后一定观察期内，猫角膜内皮细胞形态正常，并且具有较强的增殖、蛋白表达、分泌和粘附功能。基因转染具有双重性，端粒酶基因转染也不另外，掌控不合理或失去掌控可能会导致细胞超微结构变化和细胞无限增殖，至于兔端粒酶逆转录酶后会不会诱发猫角膜内皮细胞的超微结构改变和细胞无限增殖，本研究由于缺乏细胞超微结构观察和远期观察，目前无法定论，有待进一步探讨。

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TELOMERASE GENE TRANSFECTION ON THE PREVENTION OF CORNEAL ENDOTHELIAL DECOMPENSATION

ZHANG Yu-yan1,2

（1.School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, jiangxi 343009, China; 2. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000,China）

: To evaluate the effects of telomerase transfection on the morphology and function of corneal endothelial cells.：Cat corneal endothelial cells cultured in vitro were divided into 3 groups randomly, as rabbit telomerase transfection group, normal control group and epidermal growth factor group. After cultured for 30 generations, cell morphology and cell ratio changes each phase in the cycle were observed, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV was detected.：Rabbit telomerase transfection group had more cells than that in the normal control group and epidermal growth factor group, stretching adherent ability of the cells with normal phenotype was enhanced, cell ratio in M phase and S phase of G2 increased significantly, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV also increased than that of the normal control group.：Rabbit telomerase transfection can promote the proliferation of cat corneal endothelial cell with normal phenotype, can strengthen the stretching adhesion ability and secretion function, it is in favor of the treatment of corneal endothelial decompensation.

telomerase; gene transfection; corneal endothelial cell; proliferation

R772.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021

1674-8085(2012)02-0084-04

2011-12-18；

2012-02-17

张愈延(1958-)，男，江西万安人，教授、主任医师，主要从事角膜病、青光眼、眼表疾病等研究(E-mail: zyy8830669@sohu.com).