艾迪注射液无菌检查方法的建立

中国人民解放军总医院药品保障中心（100853）王丽华

艾迪注射液由斑蝥、人参、黄芪、刺五加组成。艾迪注射液有清热解毒、消瘀散结的作用。临床上用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤等的治疗。近两年，艾迪注射液在临床用量较大，从用药安全出发，本文参照《中国药典》[1]规定，进行其无菌检查的建立及验证试验，同时采用经验证确认的方法检查了3批制剂，为该药无菌检查建立科学有效、可行的评价方法提供依据。

1 试验材料

1.1 供试品 艾迪注射液：5ml/支，批号：080208、080410、080518，贵州益佰制药股份有限公司。

1.2 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基（批号060215）、改良马丁培养基（批号060331）、营养肉汤培养基（批号0 7 0 4 0 4）、营养琼脂培养基（批号070409）、改良马丁琼脂培养基（批号060122）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号060216），此6种培养基均由中国药品生物制品检定所提供。稀释液为0.9%无菌氯化钠溶液，冲洗液为pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.3 培养基、溶剂均按《中国药典》2005年版附录[1]中有关规定进行配制、分装和灭菌；试验用具、玻璃器皿等均按《中国药典》2005年版附录[1]中有关规定进行灭菌，符合无菌检查要求。

1.4 验证实验用菌种（第三代） 包括：①金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，②铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，③枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，④生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]，⑤白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，⑥黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。菌种均由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心。

1.5 仪器 100级净化工作台（北京四达净化技术研究所）；全自动立式电热压力蒸汽灭菌器MLS-3020（日本三洋公司）；电热恒温培养箱WMK-08型（湖北省黄石市医疗器械厂）。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

2.1.1 取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的肉汤新鲜培养物1ml，加入9ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍系列稀释至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌悬液（用营养琼脂培养基双碟法计数），备用。

2.1.2 取经35℃培养18～24h的生孢梭菌的硫乙醇酸盐新鲜培养物1ml，加入9ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍系列稀释至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌悬液（用硫乙醇酸盐培养基中计数），备用。

2.1.3 取经23～28℃培养18～24h的白色念珠菌的改良马丁新鲜培养物1ml，加入9ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍系列稀释至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的菌悬液（用玫瑰红钠琼脂培养基双碟法计数），备用。

2.1.4 取经23～28℃培养1周的黑曲霉菌的改良马丁琼脂斜面新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液5ml洗下黑曲霉菌孢子，吸出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量，稀释至与标准比浊管浊度相当的孢子悬液，比浊后取孢子悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍系列稀释至10-5～10-7，制成50～100cuf/ml-1的孢子悬液（用改良马丁琼脂培养基双碟法计数），备用。

2.2 活菌数计数 分别取上述4种细菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿，注入营养琼脂约18～20ml，30～35℃培养48h；分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入玫瑰红钠琼脂约18～20ml，23～28℃培养72h。细菌和真菌数计数结果见附表1。判断标准：每lml菌液中含菌量小于100CFU／皿。

2.3 培养基的灵敏度检查[2]取每管装有12ml硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种上述50～100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，每支接种量为1ml，另1支不接种作为细菌空白对照，置规定的温度培养3天；取每管装有9ml的改良马丁培养基5支，分别接种上述50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接种量为1ml，另1支不接种作为真菌空白对照，置规定的温度培养5天，逐日观察结果。以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，对照阴性澄清即无菌生长。试验结果，该培养基的灵敏度检查符合要求（见附表2）。

2.4 验证方法 采用直接接种法[3]。取22ml硫乙醇酸盐流体培养基13管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各3管；其中2管接入供试品2ml，另一管作为阳性对照，余1管为空白对照；取22ml改良马丁培养基7管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各3管。其中2管接入供试品2ml，另一管作为阳性对照，余1管为空白对照，所有培养基置规定温度培养5d（结果见附表3）。

2.5 供试品的无菌检查 按照验证过的无菌检查方法进行3供试品检查。分取供试品各11支，将每支供试品各取2m1按直接接种法分别加至22ml硫乙醇酸盐流体培养基及22ml改良马丁培养基中，并设阳性对照、阴性对照。3批供试品均无菌生长，结果符合规定。

附表1 活菌数计数结果（g/L）

附表2 培养基的灵敏度检查结果

附表3 艾迪注射液无菌检查方法验证

3 讨论

3.1 无菌检查法是对该药品质量控制的重要检查项目，《中国药典》2005年版[1]要求建立药品的无菌检查法时要进行方法学验证，验证方法主要考虑的是供试品在该试验条件下有、无抑菌活性。按照《中国药典》2005年版[1]的要求，以金葡球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作为试验菌种，对艾迪注射液无菌检查方法进行了验证。

3.2 试验表明，按《中国药典》规定的样品检验量及检验条件下艾迪注射液无干扰因素存在，通过试验建立的艾迪注射液无菌检查法——直接接种法，能确实、客观、简便地反映该注射液液是否染菌的情况，不必考虑进一步采用稀释法、薄膜过滤法等方法来消除干扰。验证试验结果表明，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。

综上所述，经方法学验证，该方法准确可靠，可作为艾迪注射液的无菌检查法。