防腐剂对地衣芽孢杆菌的抑制效果

2012-10-18柳艳霞魏法山李苗云赵改名高晓平李青阳孙灵霞张秋会张建威黄现青

食品科学 2012年3期

陈晓，柳艳霞，魏法山，李苗云，赵改名，高晓平，李青阳，孙灵霞，张秋会，田玮，张建威，黄现青,*

(1.河南农业大学食品科学技术学院，河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南郑州 450002；2.河南省产品质量监督检验院，河南郑州 450004；3.河南农业大学生命科学学院，河南郑州 450002)

防腐剂对地衣芽孢杆菌的抑制效果

陈晓1，柳艳霞1，魏法山2，李苗云1，赵改名1，高晓平1，李青阳3，孙灵霞1，张秋会1，田玮1，张建威1，黄现青1,*

通过药敏纸片法、最小抑菌质量浓度(MIC)法测定地衣芽孢杆菌对不同防腐剂的敏感性，利用正交试验设计筛选出最佳的防腐剂组合，并对获得的最佳防腐剂组合的抑菌效果进行验证。结果表明：地衣芽孢杆菌对山梨酸钾、乳酸钠不敏感；对Nisin、ξ-聚赖氨酸和尼泊金乙酯较为敏感，在20mg/mL时其抑菌圈直径分别为9.25、10mm和7.5mm，MIC分别为0.078、0.078mg/mL和2.5mg/mL。正交试验结果表明：当Nisin、ξ-聚赖氨酸和尼泊金乙酯质量浓度分别为0.313、0.313mg/mL和0.125mg/mL时，对地衣芽孢杆菌的抑制效果最佳，可使基质中的地衣芽孢杆菌数(空白样品中为5.48(lg(CFU/g))降低2(lg(CFU/mL))。选择这一最佳组合分别对其在肉制品、乳制品、果汁中的应用效果进行测定，结果显示在0～4℃条件下，复配防腐剂的效果较好。

防腐剂；地衣芽孢杆菌；菌落总数

肉及肉制品的营养极为丰富，是多种微生物良好的培养基，地衣芽孢杆菌是从肉中分离出的革兰氏阳性芽孢杆菌，能产生蛋白分解酶，使动植物组织发生腐败分解[1]，其在一定程度上可使肉表面颜色发暗，并产生难闻的臭味。由微生物引起的食品霉变、腐败对人类的生产和生活带来很大的影响，造成了巨大的损失[2]。为了稳定食品的化学性质，防止和抑制细菌的生长，必须在食品的加工过程中加入一系列食品防腐剂来延长保存期[3]。食品防腐剂不影响食品的味道，它可以抑制微生物的生长，杀死食品中含有的有害微生物，以此来防止影响食品保鲜的化学过程，例如发酵、霉变和腐败等[4]。所以，添加食品防腐剂是防止食品腐败变质的重要手段之一。

目前，在食品工业中使用的防腐剂多为化学性防腐剂，虽然具有较强的抗菌作用，但其长期使用存在着一定的安全隐患，如有一定的毒副作用、对生态环境造成不利的影响等问题[5-6]。由于化学品食品防腐剂存在潜在的毒性，因此从自然资源中提取天热防腐剂就成了亟待解决的问题[7]。生物防腐剂具有高效、无毒、适用性广，性能稳定等优点，逐渐成为食品加工研究应用的热点[8]。并且，生物防腐剂的多年研究和应用中均没有发现微生物对生物防腐剂形成抗性，显著提高了食品的安全性[9-10]。开展生物型防腐剂的复配应用研究，以提高防腐效果、拓宽抗菌谱和降低成本，是今后生物型防腐剂研究的重要方向[11]。据此，本实验研究地衣芽孢杆菌对那他霉素、Nisin、山梨酸钾、乳酸钠、ξ-聚赖氨酸和尼泊金乙酯的敏感性，并通过正交试验优化出复合防腐剂的最佳配方，并对其在肉品、乳品和果汁制品中的应用效果进行研究，旨为延长其货架期提供研究基础，为企业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜猪里脊肉、猕猴桃、鲜奶(均不含防腐剂)均为市售。

Nisin、ξ-聚赖氨酸由浙江银象生物工程有限公司惠赠；山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯(均为食品级)；牛肉浸膏、蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂；平板计数琼脂北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 菌种与培养基

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)标准株购自中国科学院微生物所。

LB液体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH7.2～7.4；LB固体培养基：在LB液体培养基中加入15g/L琼脂粉；平板菌落计数琼脂培养基：称取培养基23.5g，加入到1L蒸馏水中加热煮沸溶解后分装。以上培养基均在121℃灭菌15min[12]。

1.3 方法

1.3.1 敏感性实验研究

分别采用药敏纸片法和最小抑菌质量浓度法(MIC)测定地衣芽孢杆菌对各防腐剂的敏感性，具体操作参照文献[13]进行。

1.3.2 正交试验设计

根据敏感性实验结果，由药敏纸片法确定出Nisin、ξ-聚赖氨酸、尼泊金乙酯3种敏感性较高的防腐剂作为正交试验的3个因素，由MIC法的结果确定出正交试验中3个因素各自的水平，设计三因素三水平正交试验，以筛选最优的防腐剂复配组合。

1.3.3 实际样品的检测

利用优化后的最佳配方，以新鲜里脊肉、鲜乳、猕猴桃汁为基质，分别于25℃和0～4℃环境内放置，25℃条件下每隔2d取样测定1次，0～4℃条件下每隔5d取样测定1次，计算样品中的细菌总数，研究复合防腐剂对地衣芽孢杆菌的抑制效果。

1.4 菌落计数

参照GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板倾注法[14]测定。

2 结果与分析

2.1 药敏纸片法测定结果

利用药敏纸片法测定不同防腐剂对地衣芽孢杆菌抑菌圈的大小，确定地衣芽孢杆菌对不同防腐剂的敏感性，结果如表1所示，尼泊金乙酯、ξ-聚赖氨酸、Nisin对地衣芽孢杆菌有抑菌作用，在质量浓度为20mg/mL时抑菌圈直径分别是7.5、10mm和9.25mm。

表1 抑菌圈直径Table 1 Inhibition zone diameters of different preservativesmm

2.2 最小抑菌质量浓度法测定结果

以96孔微量酶标板测定MIC，利用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，结果表明，尼泊金乙酯、ξ-聚赖氨酸和Nisin的MIC分别为2.5、0.078、0.078mg/mL。考虑到它们在国标中的限量[15]，最终确定用于正交试验中尼泊金乙酯的质量浓度分别为0.25、0.125mg/mL和0.0625mg/mL，ξ-聚赖氨酸的质量浓度分别为0.313、0.078mg/mL和0.02mg/mL，Nisin的质量浓度分别为0.313、0.078mg/mL和0.02mg/mL。

2.3 正交试验结果

由表2可知，3种防腐剂的抑菌性由强至弱依次为ξ-聚赖氨酸＞Nisin＞尼泊金乙酯，最优组合为A1B1C2。在此条件下，进行验证实验，其细菌总数为3.48(lg(CFU/mL))比基质中地衣芽孢杆菌(5.48(lg(CFU/mL))降低2(lg(CFU/mL))，故确定用于实际样品测定的最优组合为A1B1C2，即Nisin 0.313mg/mL、ξ-聚赖氨酸0.313mg/mL、尼泊金乙酯0.125mg/mL。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal array design and results

2.4 样品的测定结果

表3 不同食品介质应用实验结果Table 3 Anti-Bacillus licheniformis effects of the optimal preservative combination in three different foods lg(CFU/g)

由表3可知，3种样品无论在低温还是在室温贮藏，加入最佳复配防腐剂后均可有效地减缓细菌的增殖。在室温条件下，原始菌数在104～106CFU/g条件下，猕猴桃汁、里脊肉、牛乳在经过4d放置后，其中细菌数分别增长1.04、3.57、2.45(lg(CFU/g))。在0～4℃放置时，猕猴桃汁、里脊肉在放置5d后其细菌总数分别增长了1.18、0.29(lg(CFU/g))，而牛乳样品中细菌总数不仅没有增加反而降低了1.36(lg(CFU/g))。3种样品的腐败速度以肉糜最快，而猕猴桃汁最慢，可能与猕猴桃中含有丰富的VC、pH值较低等原因有关[16]。

3 结论

Nisin、ξ-聚赖氨酸和尼泊金乙酯对地衣芽孢杆菌有较明显的抑制作用，其最小抑菌质量浓度分别为0.078、0.078mg/mL和2.5mg/mL。正交试验结果表明，当它们的质量浓度分别为0.313、0.313mg/mL和0.125mg/mL时，可以使基质中的地衣芽孢杆菌(空白样品5.48(lg(CFU/mL)))降低2(lg(CFU/mL))，是最佳的复配方案。对实际样品的检测结果显示，在0～4℃的条件下，复配防腐剂的效果较好，可使猕猴桃贮藏5d，使里脊肉和牛乳贮藏10d。

[1] 王长远. 肉与肉制品中的微生物及其检测[EB/OL]. http∶//www.foodmate.net/lesson/32/07.php. 2005-02-22.

[2] 肖燕清, 白卫东, 钱敏. 我国食品防腐剂的发展现状及对策[J]. 中国调味品, 2010(11)∶ 35.

[3] HOLLEY R A, PATEL D. Improvement in shelf-life and safety of perishable foods by plant essential oils and smoke antimicrobials[J]. Food Microbiolog, 2005, 22(4)∶ 273-292.

[4] MASLOWSKA J, WI D OCHA M. Thermal decomposition of some chemical compounds used as food preservatives and kinetic parameters of this process[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2000, 60(1)∶ 305-312.

[5] 谢俊杰, 佘世望, 许扬, 等. 食品防腐新领域∶ 微生物天然防腐剂[J].食品科学, 1999, 20(1)∶ 13-14.

[6] ABEE T, KROCKEL L, HILL C. Bacteriocins∶ modes of actions and potentials in food preservation and control of food poison[J]. Food Microbiology, 1995, 28(2)∶ 169-185.

[7] HOU Lixia, SHI Yonghui. Inhibition of foodborne pathogens by Hf-1, a novel antibacterial peptide from the larve of the housefly(Musca domestica)in medium and orange juice[J]. Food Control, 2007, 18(11)∶ 1350-1357.

[8] 张百刚, 张宝善. 生物防腐剂在食品加工中的应用研究[J]. 食品研究与开发, 2004, 25(6)∶ 127.

[9] BELEWU M A, BELEWU K Y, NKWUNONWO C C. Effect of biological and chemical preservatives on the shelf life of West African soft cheese[J]. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(10)∶ 1076-1079.

[10] 高兆银, 李敏, 胡美姣, 等. 壳聚糖涂膜对香蕉保鲜生理和防腐效果初步研究[J]. 浙江农业科学, 2007(3)∶ 278-280.

[11] 郝利萍, 夏延斌. 食品添加剂[M]. 北京∶ 中国农业大学出版社, 2002.

[12] 王向阳, 管佳. 天然防腐剂对萝卜干腐败微生物的控制研究[J]. 中国调味品, 2008(11)∶ 35.

[13] 雷质文. 肉及肉制品微生物监测应用手册[M]. 北京∶ 中国标准出版社, 2008∶ 397-402.

[14] GB/T 4789.2—2010菌落总数的测定[S].

[15] GB 2760—2007食品添加剂使用卫生标准[S].

[16] 徐幸莲, 彭增起, 邓桑贵. 食品原料学[M]. 北京∶ 中国计量出版社,2006∶ 116-120.

Inhibitory Effects of Different Preservatives onBacillus licheniformis

CHEN Xiao1，LIU Yan-xia1，WEI Fa-shan2，LI Miao-Yun1，ZHAO Gai-ming1，GAO Xiao-ping1，LI Qing-yang3，SUN Ling-xia1，ZHANG Qiu-hui1，TIAN Wei1，ZHANG Jian-wei1，HUANG Xian-qing1,*
(1. Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control, College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；2. Henan Province Product Quality Supervision and Inspection Center,Zhengzhou 450004, China；3. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The sensitivity ofBacillus licheniformisto different preservatives was tested by disk diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC) assay. The optimal combination of preservatives againstBacillus licheniformiswas determined using orthogonal array design method and validated. The results showed thatBacillus licheniformiswas not sensitive to natamycin, sorbic acid, potassium and sodium lactate, but sensitive to nisin,ε-polylysine and ethylparaben, revealing an inhibition zone diameter of 9.25, 10 mm and 7.25 mm and an MIC of 0.078, 0.078 mg/mL and 2.5 mg/mL, respectively. The combination of nisin,ε-polylysine and ethylparaben at respective concentrations of 0.313, 0.313 mg/mL and 0.125 mg/mL showed the best inhibitory effect onBacillus licheniformiswith a 2(lg(CFU/g)) decrease 5.48(lg(CFU/g)) for the blank sample.Furthermore, the preservative combination indicated better inhibitory effect onBacillus licheniformisin meat products, dairy products and juice during storage at 0－4 ℃.

preservatives；Bacillus licheniormis；total plate count

TS201.3

1002-6630(2012)03-0089-03

2011-03-28

公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903012)；河南省基础与前沿技术研究计划项目(082300430050)

陈晓(1989—)，女，硕士研究生，研究方向为肉品科学与食品微生物。E-mail：810906070@qq.com

*通信作者：黄现青(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为肉品科学与食品微生物。E-mail：hxq8210@126.com