安脑丸对实验性脑出血大鼠的保护作用

梁 慧 王 郑 梅元武

目前，脑出血是临床上常见的一种神经系统疾病，其病死率、残废率较高，幸存者常遗留有不同程度的高级神经功能缺损，严重影响患者生活质量，且近年来其发病率有逐渐提高及平均发病年龄有年轻化的趋势，因此对于脑出血的研究具有十分重要的社会价值和临床意义。脑出血后脑损伤除了血肿本身引起的占位效应外，还包括凝血素产生的凝血连锁反应、红细胞裂解后血红蛋白诱导的毒性反应、炎性反应及小胶质细胞的激活、神经细胞的凋亡等引起的继发性脑组织损伤［1］，故通过抑制炎性反应、减少神经细胞的凋亡、促进神经元的恢复与再生等可以减轻脑出血后脑组织损伤。核因子-kB（NF-kB）是一种广泛存在、功能多样的核转录因子，参与多种炎症相关基因的表达和调控，与脑缺血再灌注损伤的炎症机制密切相关［2，3］。神经生长相关蛋白-43（GAP-43）是一种特异性地与神经细胞生长、发育和再生相关的磷酸蛋白，可促进神经元的生长发育、再生和突触的重构。半胱氨酸天冬氨酸中等异性蛋白酶-3（Caspase3）是目前已知的凋亡执行的关键因子，在凋亡过程中水解DNA、组织蛋白，通过抑制Caspase3后可大大减轻凋亡［4］。安脑丸主要是由人工牛黄、水牛角浓缩粉、猪胆汁粉、黄连、黄芪、栀子、石膏、郁金、薄荷脑、珍珠母、珍珠、赭石、冰片组成，是在中药安宫牛黄丸的基础上研制演变而来的；与安宫牛黄丸相比，其具有以下优势特点：用人工牛黄替代了天然牛黄、猪胆汁粉和水牛角浓缩粉替代犀牛角解决了安宫牛黄丸中的贵稀料受限问题，增加了薄荷脑、石膏、赭石、珍珠母而强化祛痰清热作用，且去掉了重金属，使用药更安全；其中，黄连、黄芪、栀子可清热解毒、泻火除烦；冰片有扩张软化血管、改善血脑屏障通透性、增强药物向脑内转运作用，故本研究通过观察安脑丸对实验性脑出血大鼠血肿周围 NF-kBp65、GAP-43、Caspase3表达水平的影响，研究安脑丸对脑出血后神经细胞的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠190只，体重（220±20）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。190只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、安脑丸组，正常组10只大鼠，5只用于免疫组化检测，5只用于Western blot检测；其余每组60只大鼠，按每个时间点10只随机分为术后12 h、1、2、4、7、10 d六个时间点进行处理，每个时间点5只用于免疫组化检测，5只用于western blot检测。正常组：正常饲养，自由饮水；假手术组：用生理盐水代替胶原酶注入苍白球后，正常饲养及自由饮水；模型组：大鼠造模后正常饲养及自由饮水；安脑丸组：大鼠造模后安脑丸灌胃，各组均在术前6 h灌胃1次（1 mg／ml，10 ml／kg），且在大鼠手术清醒后开始灌胃，每天上下午各1次，直至处死。

1.2 实验材料

Ⅶ型胶原酶（sigma公司）、安脑丸（由哈尔滨蒲公英药业有限公司提供）、鼠抗体免疫组化（DAB）试剂盒（北京欣博盛生物科技公司）、caspase3抗体、NF-kBp65 抗 体 （GeneTex 公 司 ）、STOELTING TL-2型鼠脑立体定位仪（美国）、光学显微镜（日本Olympus公司）、微量进样器、手术镊、手术剪等手术器械（上海医疗器械厂）。

1.3 脑出血模型的制作

按照Rosenberg法制作大鼠脑出血模型［5］：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于脑立体定位仪上，根据《大鼠立体定位图谱》［6］进行苍白球定位：前囟后1.4 mm，矢状线右侧旁开3.2 mm，在颅骨表面开一小孔，向下进针5.6 mm，通过微量注射器向右侧苍白球内缓慢注射含有0.2 U／μl的Ⅶ性胶原酶的生理盐水2μl，留针5 min。假手术组用生理盐水代替胶原酶，过程同前。

1.4 动物行为学及神经功能缺损评分

术后大鼠清醒后按Longa［7］等创立的5级神经功能缺损评分方法进行神经功能缺损评分。0级：无神经功能缺陷；1级：不能完全伸展缺血对侧前肢（为轻度局灶神经功能缺损）；2级：向缺血对侧转圈（为中度局灶神经功能缺损）；3级：向缺血对侧倾倒（为重度局灶神经功能缺损）；4级：不能自发行走，昏睡。神经功能评分在2级以上的大鼠视为造模成功，纳入实验，剔除神经功能评分0级或4级者，并予以补充。

1.5 免疫组化染色

将大鼠用10%水合氯醛麻醉后迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，快速灌入200 ml左右生理盐水，再用4℃预冷的4%多聚甲醛溶液400 ml，先快后慢进行灌注固定，取脑固定于同样4%多聚甲醛内过夜固定，再置入20%、30%蔗糖溶液，待组织沉底后人恒冷切片机进行连续冠状位切片，片厚约30μm，保存备用。切片放入3%H2O2溶液，室温1 h，以消除内源性过氧化物酶；正常羊血清室温封闭30 min；分 别 加 入 兔 抗 NF-kBp65、兔 抗 GAP-43、兔 抗Caspase3一抗，4℃孵育24 h；分别滴加二抗工作液（NF-kBp65、GAP-43、Caspase3抗兔）室温反应30 min；滴加辣根酶标记卵白素工作液，室温反应30 min；DAB显色剂显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗3次终止反应；以上操作除滴加封闭液后勿洗之外，其他步骤之间均用0.1 mol／LPBS清洗5 min×5次。对照试验用PBS代替一抗进行实验。每个指标每组每个时间点取5张切片，在每张切片的阳性细胞区域随机选取5个不同视野，400倍光镜下计算每个视野的阳性细胞数目，取平均值代表该张切片阳性细胞数；同法计数每组各时间点切片的阳性细胞数，总平均数代表该组时间点的阳性细胞数。

1.6 Western blot检测

各组每个时间点各取5只大鼠用10%水合氯醛麻醉，快速取脑，用刀片切取脑血肿周围脑组织块置入匀浆器中，剪碎，加单去污剂裂解液400 ul，匀浆，置于冰上30 min后移置1.5 ml离心管中，在4℃下12 000 r／min离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中，置于－20℃冰箱保存备用，用Bradford法测蛋白含量，并调节蛋白浓度。等量蛋白样品（50 μl）经10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，然后转至硝酸纤维素膜后室温下封闭2 h，加入Caspase3一抗，置4℃过夜后，加入相应辣根过氧化物酶偶联二抗，室温摇床2 h后采用增强型化学发光显色系统显示蛋白条带，经自动电泳凝胶成像分析仪采集，测定灰度值。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠神经功能缺损评分

按Longa神经功能缺陷评分法在手术大鼠清醒后2 h进行神经功能缺损评分，模型组和安脑丸组均出现明显偏瘫症状，安脑丸组在4个时间点评分均优于模型组（P＜0.05）；正常组及假手术组大鼠清醒后均无明显肢体运动障碍（表1）。

2.2 免疫组化法检测NF-kBp65阳性细胞表达水平

NF-kBp65表达以细胞浆或细胞核呈黄褐色为阳性细胞，脑出血脑组织中NF-kBp65阳性细胞主要表达于血肿周围区及出血侧皮质。正常组和假手术组脑组织内NF-kBp65阳性表达极少，两组间无显著性差异（P＞0.05）；模型组与安脑丸组NF-kBp65阳性细胞数较正常组和假手术组多（P＜0.01）；模型组与安脑丸组脑出血后12 h NF－kBp65阳性细胞数明显增多，4 d时NF-kBp65阳性细胞数达到高峰，10 d时仍可见到NF-kBp65阳性细胞表达，安脑丸组脑出血后各时间点的NF－kBp65阳性细胞数均明显少于模型组（P＜0.05）（表2及图1）。

2.3 免疫组化法检测GAP-43阳性细胞表达水平

GAP-43阳性细胞表达主要为细胞浆着棕黄色，着色部位主要见于血肿周围与大脑皮质的神经元。正常组、假手术组脑组织仅存在少量GAP-43阳性细胞表达，两者间无显著性差异（P＞0.05）；模型组和安脑丸组GAP-43阳性细胞数均较正常组及假手术组多（P＜0.01）；脑出血后12 h模型组GAP-43阳性细胞数显著增多，2 d时GAP-43阳性细胞数达高峰，以后逐渐降低，至第10 d时仍多于正常组（P＜0.01）；脑出血后安脑丸干预组各时间点GAP-43阳性细胞数均多于模型组（P＜0.01）（表3和图2）。

2.4 免疫组化法检测Caspase3阳性细胞表达水平

Caspase3阳性细胞表达主要是胞浆着黄褐色，正常组未见明显阳性细胞表达，假手术组见到少量Caspase3阳性细胞表达；模型组大鼠脑组织血肿周围有caspase3阳性细胞表达，大鼠脑出血后12 h即可见到阳性细胞表达，1d阳性细胞数达到高峰，之后开始下降，10 d时仍有表达，高于正常组（P＜0.01）；模型组、安脑丸组各时间点阳性细胞数较假手术组明显增多（P＜0.01）；安脑丸组出血后血肿周围Caspase3阳性细胞数明显低于模型组（P＜0.05）（表4和图3）。

2.5 Western blot检测Caspase3蛋白表达水平

脑出血后12h模型组大鼠Caspase3蛋白表达水平明显升高，1 d时达到高峰，各时间点均明显高于正常组和假手术组（P＜0.01）；脑出血后安脑丸各时间点Caspase3蛋白表达水平明显低于模型组（P＜0.01）（图4）。

表1 4组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较（±s，n＝5，分）

表1 4组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较（±s，n＝5，分）

注：与模型组比较，＊P＜0.01

组别神经功能缺损评分术后12 h 术后1 d 术后2 d 术后4 d 术后7 d 术后10d正常组000000假手术组 0 0 0 0 0 0模型组 2.64±0.31 2.38±0.26 2.06±0.11 1.90±0.16 1.88±0.13 1.72±0.08安脑丸组 2.38±0.26 2.22±0.13 1.58±0.13＊ 1.48±0.13＊ 1.30±0.07＊ 1.18±0.08＊

表2 各组NF-kBp65阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

表2 各组NF-kBp65阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

注：与假手术组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01，▲P＜0.05

组别NF-kBp65阳性细胞数12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手术组 2.88±0.60 2.28±0.51 1.95±0.63 2.24±0.60 1.43±0.39 1.11±0.13模型组 35.20±4.39＊ 48.98±6.02＊ 51.18±8.22＊ 72.98±9.43＊ 39.78±9.20＊ 24.23±7.04＊安脑丸组 28.17±3.34＊▲ 33.00±6.05＊△ 30.51±7.52＊△ 36.41±5.44＊△ 18.62±5.60＊△ 10.76±3.44＊△

表3 各组GAP-43阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

表3 各组GAP-43阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

注：与假手术组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别GAP-43阳性细胞数12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手术组 2.28±0.56 2.92±0.44 2.26±0.68 1.98±0.41 1.64±0.47 1.56±0.93模型组 10.08±1.35＊ 20.42±3.08＊ 36.32±3.13＊ 24.32±3.12＊ 18.96±1.92＊ 15.62±3.56＊安脑丸组 19.00±1.41＊△ 33.66±4.37＊△ 59.84±4.06＊△ 60.30±9.19＊△ 34.58±6.40＊△ 28.94±2.69＊△

表4 各组Caspase3阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

表4 各组Caspase3阳性细胞数（±s，n＝5，个／每400倍视野）

注：与假手术组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01，▲P＜0.05

组别Caspase 3阳性细胞数12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手术组 3.39±0.83 3.53±1.03 2.66±0.91 2.08±0.57 1.80±0.39 1.59±0.30模型组 30.21±6.98＊ 64.41±8.65＊ 49.48±7.92＊ 41.00±6.71＊ 29.55±4.59＊ 22.21±3.37＊安脑丸组 20.41±3.95＊▲ 42.89±6.25＊△ 31.11±4.29＊△ 21.41±3.61＊△ 14.64±4.14＊△ 10.79±3.40＊△

图1 脑出血后NF-kBp65阳性细胞数

图2 脑出血后GAP-43阳性细胞数

图3 脑出血后Caspase3阳性细胞数

图4 脑出血后Caspase3蛋白表达水平

3 讨 论

NF-kB是一种多向性的转录调节因子，广泛存在于神经系统的多种细胞中，如单核巨噬细胞、神经细胞、胶质细胞等。在正常情况下NF-kB由NF-kBp50和NF-kBp65两个蛋白亚基组成二聚体，与其抑制物IkB结合，存在于几乎所有类型细胞胞质中，只有受到各种活化因素的作用后才能被激活［8～10］。Wang等研究表明脑出血后NF-kB的活化及表达与继发性脑组织损伤有明显关系［11］，其活化后可促进多种炎症因子和介质的释放和激活形成复杂的炎症反应网而加重脑损伤，在脑血管疾病后的炎症反应中起着中心环节的作用［12］，故通过抑制脑出血后NF-kB的表达可以减少脑出血后炎症反应进而减少脑组织损伤。本研究发现正常组中仅有极少量NF-kBp65阳性细胞表达，脑出血后12 h血肿周围NF-kBp65阳性细胞表达明显增高，4 d时达高峰，10d时仍可见NF-KBp65阳性细胞表达，安脑丸组各时间点NF-kBp65阳性细胞数均少于模型组（P＜0.01）；故本研究推测安脑丸可以通过抑制NF-kB表达而减少脑出血后炎症反应，起到一定的神经保护作用。

GAP-43是神经元特异性胞膜磷酸蛋白，广泛存在于神经组织中，参与神经细胞生长及突触发育成熟和再生，对于神经系统发育中的轴突生长和突触形成有重要的作用，被认为是神经元生长的内在决定因子，是神经元可塑性的一种分子标志物，神经损伤与再生时轴突内其含量可成倍增加［13～15］。脑出血是一种临床急症，在脑出血后除了释放一系列细胞损伤因子外，还可通过释放一些神经营养因子而激活神经元的自我保护机制。本研究通过设计胶原酶诱导的脑出血模型，观察到脑出血后12 hGAP-43表达迅速增高，在2 d时表达达到高峰，而后逐渐降低，一直到脑出血后第10d模型组表达仍明显高于正常组，而安脑丸组各时间点GAP-43阳性细胞数均多于模型组（P＜0.05）。因此，本研究推测安脑丸是通过促进血肿周围神经胶质细胞或神经元合成GAP-43，作用于自身或邻近神经元进而对缺氧缺血神经细胞起保护作用，促进脑出血后神经恢复，减轻脑出血后周围神经细胞的坏死。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种不同于细胞坏死的细胞死亡形式，是一种机体清除损伤坏死细胞而保持内环境平衡的自我调节机制。Karwacki等研究表明实验性脑出血后血肿中心及其周围均可发现大量凋亡的神经细胞，故认为细胞凋亡机制可能参与了脑出血继发性脑组织损害［16，17］。天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶家族（Caspases）是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，通过对蛋白激酶、核酸酶、细胞骨架蛋白的裂解，激活特定信号系统，导致DNA片段形成、染色质固缩等凋亡现象，进而引起细胞凋亡，而Caspase3是Caspases级联反应中最重要的共同下游效应分子，是细胞凋亡蛋白酶级联反应中的必经之路［18，19］，抑制Caspase3表达后可大大减轻凋亡［2］。本实验结果显示脑出血后12 h后大鼠血肿周围Caspase3表达增加，显著高于正常组（P＜0.01），1 d时Caspase3表达达到高峰，以后逐渐降低，10 d时表达仍高于正常组和假手术组；安脑丸干预后各时间点Caspase3表达水平均明显低于模型组（P＜0.01），表明安脑丸可降低脑出血后Caspase3蛋白表达水平，故本研究推测安脑丸可以通过降低Caspase3的表达水平而减少神经细胞凋亡进而减少脑出血后神经细胞的损害。

综上所述，本研究推测安脑丸可以（1）通过抑制NF-kB的表达而减少脑出血后脑组织炎性反应；（2）通过促进血肿周围神经细胞或神经胶质细胞释放GAP-43，促进脑出血后神经修复与再生，减轻脑出血后周围神经细胞的坏死；（3）通过降低Caspase3蛋白的表达减少神经细胞的凋亡，减轻脑出血后脑组织的损害程度三方面对脑出血后脑组织有一定的保护作用。这些证据为使用安脑丸治疗脑出血疾病提供了一定的理论依据，然而其在临床应用上的价值还有待进一步的研究证实。

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