多菌复合馒头发酵剂工业培养基的优化

张春辉，孙庆申，2，吴 桐，2，李 冰，韩德权，2

（1．黑龙江大学 生命科学学院 微生物黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨 150080；2．农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500）

当今，复合发酵剂应用十分广泛。大多集中于酸奶发酵、香肠发酵和饲料发酵［1－3］等领域，所有关于复合面食发酵剂的研究报道几乎全部都是由各菌种单独培养后混合而成［4－6］，而并不是混合培养［7］。加之，实验室研究使用昂贵药品配制培养基，不切合复合馒头发酵剂工业化生产的实际。本试验以单因素试验为基础，运用正交试验设计对多菌复合馒头发酵剂混合培养工业培养基进行优化，以期获得最佳的工业培养基配方。

1 材料与方法

1．1 材 料

1．1．1 菌 种

面包酵母 （Saccharomyces cerevisiae）和副干酪乳杆菌 （Lactobacillus paracasei）：本实验室分离；嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）：黑龙江大学食品科学实验室保存；异常汉逊酵母（Hanseula anomala）：菌种编号2．592，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1．1．2 培养基

MRS液体培养基：按照文献 ［8］的方法配制，121℃灭菌20min备用。

YEPD－溴甲酚绿固体培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，溴甲酚绿0．01 mg／L。112℃灭菌20min。

1．2 方 法

1．2．1 培养方法

混合培养工艺［9］。

1．2．2 测定方法

总生物量测定：混合培养后，利用分光光度计在550nm处测定吸光值，间接反映总生物量。

培养基残糖测定：蒽酮比色法［10］。

面包酵母计数：稀释平板计数法，无菌水稀释适当倍数，取0．1mL涂YEPD－溴甲酚绿平板，37℃培养，计数面包酵母菌落。

1．2．3 优化方法

以玉米粉糖化液为碳源、豆粕粉水解液为有机氮源、硫酸铵为无机氮源、玉米浆作生长因子，采用单因素法和正交试验设计［11－12］优化多菌复合馒头发酵剂混合培养工业培养基。

1．2．3．1 碳源最适浓度范围选择试验

以1%豆粕水解液和0．3%硫酸铵作混合氮源，添加 0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的玉米粉糖化液作碳源，0．5%玉米浆配制培养基，调初始pH＝6．0，灭菌。根据文献 ［9］培养工艺操作，对面包酵母菌落计数，确定玉米粉糖化液最适浓度范围。

1．2．3．2 氮源最适浓度范围选择试验

1）豆粕水解液作有机氮源。用已确定的玉米粉糖化液添加量，以豆粕水解液作有机氮源，添加量为0%、2%、4%、6%、8%、10%，硫酸铵0．3%，玉米浆0．5%配制培养基，调初始pH＝6．0。根据文献 ［9］培养工艺操作，对面包酵母菌落计数，确定豆粕水解液最适浓度范围。

2）硫酸铵作为无机氮源。用已确定的玉米粉糖化液添加量，以0%、0．25%、0．5%、0．75%、1%、1．25%硫酸铵作无机氮源，玉米浆0．5%，豆粕水解液按试验确定浓度添加，配制培养基，调初始pH＝6．0。根据文献 ［9］培养工艺操作。对面包酵母菌落计数，以确定硫酸铵最适浓度范围。

1．2．3．3 玉米浆最适浓度范围选择试验

用试验已确定的碳氮源浓度，用0%、0．5%、1%、1．5%、2%的玉米浆作生长因子，调初始pH＝6．0。根据文献 ［9］培养工艺操作，对面包酵母菌落计数以确定玉米浆浓度范围。

1．2．3．4 正交试验设计优化工业培养基

根据前期单因素试验，优选各因素3个水平采用4因素3水平 ［L9（34）］正交试验设计。

表1 正交设计因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design／%

2 结果与分析

2．1 单因素法确定各因素最适浓度范围

2．1．1 碳源最适浓度范围选择

图1中，当浓度为12%和14%时的面包酵母生物量分别为 （6．8±0．136 5）×108cfu／mL和 （6．8±0．215 0）×108cfu／mL，p＝0．767 （p＞0．05），说明玉米粉糖化液浓度12%和14%对面包酵母生物量影响不显著，故选择玉米粉糖化液浓度为12%。

2．1．2 氮源最适浓度范围选择

2．1．2．1 豆粕水解液作有机氮源

图1 玉米粉糖化液浓度对面包酵母生物量影响Fig．1 Effect of the corn saccharification solution concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

图2中，随着豆粕水解液浓度的增加，面包酵母的生物量变化不明显。当浓度为0%和2%时的面包酵母生物量分别为 （3．4±0．18）×108cfu／mL和 （4．0±0．096）×108cfu／mL，p＝0．023（p＜0．05），说明豆粕水解液浓度0%和2%对面包酵母生物量影响显著。因此，选择豆粕水解液浓度2%进行下一步试验。

图2 豆粕水解液浓度对面包酵母生物量的影响Fig．2 Effect of the soybean meal hydrolyzate concentrations on the biomass of saccharomyces cerevisiae

2．1．2．2 硫酸铵作无机氮源

硫酸铵添加量与面包酵母生物量关系见图3，随着硫酸铵添加量的增加，面包酵母生物量随之增加，添加量为1．0%和1．25%时的面包酵母生物量分别 为 （5．8±0．13）×108cfu／mL 和 （5．8±0．19）×108cfu／mL ，p＝0．981 （p＞0．05），说明硫酸铵1．0%和1．25%的添加量对面包酵母生物量影响不显著，故选择硫酸铵添加量为1．0%。

2．1．3 玉米浆最适浓度范围选择

由图4可见，随着玉米浆浓度的增加，面包酵母生物量随之增加，当浓度为1%和1．5%时的面包酵母生物量分别为 （3．9±0．105 4）×108cfu／mL和 （4．0±0．113 7）×108cfu／mL，p＝0．518（p＞0．05），说明玉米浆浓度在1%和1．5%时对面包酵母生物量影响不显著，故选择玉米浆浓度1%。

2．2 正交试验设计优化工业培养基

通过单因素试验确定各因素的浓度，在此基础上选择合适的水平进行正交试验设计见表1，试验结果见表2。

由表2可见，各因素对混菌吸光值即总生物量的影响次序为：玉米粉＞豆粕＞玉米浆＞硫酸铵，其最优组合为A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸铵1%，玉米浆0．8%。以面包酵母生物量作为评判标准，各因素对面包酵母生物量的影响次序为：玉米粉＞玉米浆＞硫酸铵＞豆粕，其最优组合为A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸铵1%，玉米浆0．8%。另外明显地，玉米粉糖化液和玉米浆对面包酵母生物量具有显著影响。以残糖作为评判标准，各因素对残糖的影响次序为：玉米粉＞豆粕＞硫酸铵＞玉米浆，其最优组合为A3B3C1D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸铵0．9%，玉米浆0．8%。玉米粉糖化液对残糖具有显著影响。综上所述，确定多菌复合馒头发酵剂混合培养工业培养基配方为A3B3C2D1，即玉米粉糖化液13%，豆粕水解液3%，硫酸铵1%，玉米浆0．8%。此配方与正交试验设计第9组试验相同。经验证实验，面包酵母生物量为5．8×108cfu／mL，汉逊酵母生物量为0．9×108cfu／mL，乳酸菌总生物量为3．4×108cfu／mL。

表2 多菌复合馒头发酵剂工业培养基优化正交试验设计结果Table 2 Orthogonal test results of optimization of industrial medium for multi－microbes complex steamed bread fermentation agent

3 讨 论

混合培养一般是为了获取更多的发酵产物，已有的报道大都以获取某些纯培养无法得到的产物和利用菌株之间协同作用，提高产率为目的［13－15］。以获取菌体为目的的混合培养中试特别是不同菌属之间的研究在国内外尚未见到报道。本试验中优化后的培养基，面包酵母菌生物量和混菌总生物量都是过去本实验室培养基的几倍，与国内一些研究相比各有优劣。李翔国［16］用玉米面、葡萄糖、酵母粉和马铃薯淀粉做培养基对乳酸菌复合系培养生物量为5．0×107cfu／mL；杨丽丽［17］优化了乳酸乳球菌乳脂亚种、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的增殖培养基，混菌生物量为2．1×109cfu／mL；刘丹［18］优化了嗜酸乳杆菌的增菌培养基，优化后生物量是8．6×109cfu／mL；A．Laitila［19］采用麦芽汁培养基培养植物乳杆菌，生物量是4．0×109cfu／mL。究其生物量产生差距的原因有：①所选用培养基原料上的差别所致，文献中研究使用实验室分析纯药品，本试验中采用的是更加接近生产的玉米粉、豆粕等工业原料，营养素的浓度和纯度上存在差距；②试验培养方法为顺序接种，异常汉逊酵母、副干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌是在培养进行9h之后同时接种，再培养11h后结束，这时两株乳酸菌都还未进入对数生长期，因此本试验混菌生物量与某些研究中的生物量会有一定差距。

4 结 论

多菌复合馒头发酵剂混合培养工业培养基配方为：玉米粉糖化液13%、豆粕水解液3%、硫酸铵1．0%、玉米浆0．8%、KH2PO40．3%、MgSO4·7H2O 0．06%、MnSO40．02%，pH＝6．0。在优化的培养基上进行验证试验，面包酵母生物量提高到5．8×108cfu／mL，与正交试验结果接近，是MRS培养基获得面包酵母生物量 （1．4×108cfu／mL）的4倍以上；混菌总生物量可达到1．0×109cfu／mL。

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