树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗肾细胞癌的实验研究

韦思明，颜志中，周 剑

(1. 浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

·基础与临床研究·

树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗肾细胞癌的实验研究

韦思明1，颜志中2，周 剑3

(1. 浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

目的：探讨抗CD137抗体是否能加强树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应。方法将Renca肾癌细胞注入Balb/c小鼠皮下。3天后，小鼠被随机分为4组，分别给予未治疗、树突状细胞疫苗治疗、抗CD137抗体治疗、树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗。肿瘤种植后20天，小鼠被处死，获取脾脏分析T细胞活性。通过测量肿瘤大小来评定抗肿瘤效应。结果相比于未治疗，各种治疗显著增加了T细胞活性，抑制了肿瘤生长，尤以联合治疗的作用为最强。结论联合治疗通过增加T细胞活性来提高抗肿瘤效应。

树突状细胞疫苗;CD137;肾细胞癌

Abstract: [Objective] To investigate whether anti-CD137 antibody can potentiate antitumor effect of dendritic cell (DC) vaccine. [Method] A renal cell carcinoma model was established by subcutaneous injection of Renca tumor cells into Balb/c mice. After 3 days, tumor-bearing mice were not treated or treated with DC vaccine, anti-CD137 antibody, or both combinations. Mice were killed on day 20 after tumor cell inoculation, and spleens were harvested for analysis of T cell activity. The antitumor effect was assessed by measuring tumor size. [Result] Compared with un-treatment, different treatments significantly increased T-cell activity, and inhibited tumor growth, with the highest effect in combination therapy. [Conclusion] Combination therapy can enhance antitumor effect by increasing T-cell activity.

Keywords: DC vaccine; CD137; renal cell carcinoma

树突状细胞是体内功能最强的抗原递呈细胞。利用树突状细胞制成的疫苗已被应用于临床治疗肾细胞癌[1]。它通过激活肿瘤特异性T淋巴细胞来诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床缓解率仅为37%[1]。因此，如何加强树突状细胞疫苗的治疗效果是急需解决的重要课题。CD137(又称4-1BB)是一个协同刺激分子，主要表达在激活的T细胞上[2]。抗CD137抗体与CD137的结合可以刺激T细胞活化[3]。在本研究中，我们探讨了树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗肾细胞癌的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

8～10周龄的Balb/c小鼠购于上海实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。肾癌细胞株Renca来源于美国细胞、菌种库。重组鼠的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子α、干扰素γ购于R&D Systems公司。异硫氰酸荧光素标记的抗CD11c、CD3单抗，以及藻红蛋白标记的抗CD83、CD137单抗均购自BD PharMingen公司。T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞分离试剂盒系Miltenyi Biotec公司生产。抗鼠CD137单克隆抗体购于R&D Systems公司。铬酸钠来自PerkinElmer公司。检测干扰素γ的试剂盒购自BD PharMingen公司。

1.2 树突状细胞疫苗的制作

取Balb/c小鼠的股骨，洗出骨髓细胞。骨髓细胞与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(10 ng/ml)、白细胞介素4(10 ng/ml)等一起培养。第二天弃悬浮细胞，隔日半量换液并加入新鲜细胞因子，第7天收获未成熟树突状细胞。Renca肾癌细胞反复冻融后得到细胞溶解产物(即肿瘤抗原)。未成熟树突状细胞与肿瘤抗原以1:3比例混合培养，并加入肿瘤坏死因子α(10 ng/ml)、干扰素γ(10 ng/ml)，继续培养16小时，诱导树突状细胞成熟。负载肿瘤抗原的树突状细胞就是成熟树突状细胞，也就是树突状细胞疫苗。通过细胞表型分析来证实培养的细胞为树突状细胞。

1.3 树突状细胞表型分析

收获未成熟和成熟树突状细胞，用异硫氰酸荧光素标记的抗CD11c (树突状细胞标志)单抗、藻红蛋白标记的抗CD83(树突状细胞成熟标志)单抗染色，流式细胞仪分析细胞表面CD11c和CD83的表达。

1.4 T细胞表面CD137表达的分析

将Balb/c小鼠的脾脏制成细胞悬液，用T细胞分离试剂盒从脾细胞中分离出T细胞。纯化的T细胞(1×105/孔)单独培养在96孔培养板中，或者与树突状细胞疫苗(1×104/孔)共同培养。3天后，收获T细胞，用异硫氰酸荧光素标记的抗CD3(T细胞标志)单抗、藻红蛋白标记的抗CD137单抗染色，流式细胞仪分析CD137在T细胞上的表达。

1.5 小鼠肾肿瘤模型的制作及肿瘤治疗

取Balb/c小鼠40只，将5×105的Renca肾癌细胞接种于每只小鼠的右腹皮下。3天后，小鼠随机分成4组，每组10只。对照组：未经任何治疗。树突状细胞疫苗治疗组：在肿瘤接种后第3天与第10天，将1×106的树突状细胞疫苗注入小鼠左腹皮下。抗CD137抗体治疗组：在肿瘤接种后第3天与第10天，将100 μg抗CD137抗体注入小鼠腹腔内。联合治疗组：在肿瘤接种后第3天与第10天，将1×106的树突状细胞疫苗注入小鼠左腹皮下，在第6天与第13天，将100 μg抗CD137抗体注入小鼠腹腔内。肿瘤种植后20天，处死小鼠，用卡尺测量肿瘤的长径与横径，它们相乘的结果记录为肿瘤大小。

1.6 铬标记释放法检测细胞毒作用

以Renca肾癌细胞作为靶细胞，与铬酸钠混合培养1小时，以便靶细胞被标记上铬。肿瘤种植后20天，取对照组和不同治疗组小鼠的脾脏。用CD8+T细胞分离试剂盒从脾细胞中分离出CD8+T细胞。CD8+T细胞与树突状细胞疫苗以10:1的比例混合培养。5天后，致敏的CD8+T细胞作为效应细胞与铬标记的靶细胞混合培养，比例为100:1。4小时后取上清液，用γ计数仪测定铬释出量。通过公式：靶细胞溶解百分率=[(实验组铬释出量—自发铬释出量)/(最大铬释出量—自发铬释出量)]×100来评估CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的活性。

1.7 干扰素γ水平的检测

肿瘤种植后20天，取对照组和不同治疗组小鼠的脾脏。用CD4+T细胞分离试剂盒从小鼠脾细胞中分离出CD4+T细胞。将CD4+T细胞和树突状细胞疫苗以10:1的比例混合培养，24小时后收集上清液，采用酶联免疫吸附试验检测上清液中干扰素γ的水平。

1.8 统计学处理

采用GraphPad Prism 软件处理数据。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 树突状细胞特征

未成熟树突状细胞CD11c和CD83的表达率分别为85.9%(即3.6%+82.3%)和3.6%；成熟树突状细胞(也就是树突状细胞疫苗)CD11c和CD83的表达率分别为87.1%(即71.5%+15.6%)和71.5%，见图1。由此可见，未成熟和成熟树突状细胞均高表达CD11c(树突状细胞标志)，表明培养的细胞是树突状细胞。成熟树突状细胞CD83(树突状细胞成熟标志)表达率明显高于未成熟树突状细胞。

图1 流式细胞仪分析树突状细胞表面标志CD11c、CD83的表达

2.2 T细胞上CD137的表达

未受刺激的T细胞CD137表达率为0.9%；受树突状细胞疫苗刺激后，T细胞上CD137的表达率明显增加，为35.2%，见图2。

图2 流式细胞仪分析T细胞上CD137的表达

2.3 各种治疗方法对小鼠肾肿瘤生长的影响

表1显示：与对照组相比，树突状细胞疫苗治疗组和抗CD137抗体治疗组的肿瘤明显缩小(t=13.15,P<0.0001;t=6.89,P<0.0001)。联合治疗组的肿瘤明显小于对照组、树突状细胞疫苗治疗组及抗CD137抗体治疗组(t= 25.30,P< 0.0001;t= 10.58,P<0.0001;t=16.27,P< 0.0001)。

表1 各种治疗方法对肿瘤大小、杀伤率及干扰素γ水平的影响

注：▲：与对照组比较P<0.0001;◆：与其他3组比较P< 0.0001

2.4 细胞毒实验

表1显示：与对照组相比，树突状细胞疫苗治疗组和抗CD137抗体治疗组的CD8+T细胞对肾癌细胞杀伤率明显增加(t=15.24,P<0.0001;t=8.55,P<0.0001)。联合治疗组的杀伤率明显高于对照组、树突状细胞疫苗治疗组及抗CD137抗体治疗组(t=19.16,P<0.0001;t=6.84,P<0.0001;t=11.37,P<0.0001)。

2.5 各种治疗方法对干扰素γ水平的影响

表1显示：与对照组相比，树突状细胞疫苗治疗组和抗CD137抗体治疗组的干扰素γ水平明显提高(t=23.47,P<0.0001;t=17.93,P<0.0001)。联合治疗组的干扰素γ水平明显高于对照组、树突状细胞疫苗治疗组及抗CD137抗体治疗组(t=24.95,P<0.0001;t=7.91,P<0.0001;t=13.54,P<0.0001)。

3 讨论

肾细胞癌位居泌尿生殖系统恶性肿瘤的第二位(仅次于膀胱癌)。治疗局限性肾癌的方法是行手术切除术，但这些患者中40%仍会复发、转移[4]。此外，30%患者在首次发现肾癌时已有远处转移，此时外科手术已无能为力[5]。肾癌对化疗和放疗不敏感。因此，这类患者预后极差，平均生存时间只有9个月[1]。肾癌是一种免疫原性肿瘤，故免疫治疗是目前治疗肾癌的有效措施[6]。

肿瘤免疫过程中，抗原递呈细胞处于中心环节。树突状细胞是体内功能最强的抗原递呈细胞，它捕获加工处理肿瘤抗原并递呈肿瘤抗原给CD4+、CD8+?T细胞，刺激T细胞活化[7]。其中CD8+?T细胞活化后可以直接识别杀死肿瘤细胞，而CD4+?T细胞活化后，通过分泌干扰素、白细胞介素2等细胞因子来激活CD8+?T细胞，促进CD8+?T细胞杀伤肿瘤细胞。使用树突状细胞疫苗治疗肾癌病人已成为近几年的热点。在国外14次临床试验中，197名肾癌转移患者接受了树突状细胞疫苗治疗，73人治疗有效，占37%(73/197)[1]。其中4人肿瘤完全消失；8人肿瘤体积缩小50%以上，且没有出现新的病灶；61人肿瘤体积缩小50%以下。整个治疗过程中仅出现轻微的副作用，如：低热，疲劳，腹泻，感冒症状。以上临床试验显示：树突状细胞疫苗治疗肾癌是安全有效的，但它的临床疗效只有37%。如何提高疫苗的疗效是一个研究重点。

CD137是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，它被表达在激活的CD4+和CD8+?T细胞上[2]。已有研究报道：抗CD137抗体与T细胞上CD137的结合可以刺激T细胞活化[3]。因此，我们的设想是：用树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体治疗小鼠肾细胞癌，提高抗肾肿瘤功效。首先将树突状细胞疫苗注入小鼠体内，树突状细胞疫苗递呈肿瘤抗原给T细胞，刺激T细胞活化、表达CD137，随后将抗CD137抗体注入小鼠体内，抗CD137抗体与T细胞上的CD137结合，促进 T细胞进一步活化，增加抗肾肿瘤功效。到目前为止，国内外均未见同类研究报道。我们的研究显示：T细胞受到树突状细胞疫苗刺激后上调了CD137的表达，这为抗CD137抗体的随后应用提供了科学依据。我们还发现：相比于树突状细胞疫苗或抗CD137抗体的单一治疗，树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体显著抑制了肿瘤生长，这意味着联合治疗的协同抗癌效应。此外，在联合治疗过程中我们没有发现小鼠死亡及灵活性的改变，说明联合治疗没有明显的毒性。

通过细胞毒性试验和细胞因子分泌试验可以检测抗肿瘤免疫反应。相比于单一治疗，接受联合治疗的小鼠有更高的细胞毒性，这表明联合治疗增加了CD8+?T细胞杀伤肿瘤细胞的活性。在细胞因子分泌试验中，联合治疗的小鼠显示了更高的干扰素γ水平，这提示联合治疗提高了CD4+?T细胞分泌干扰素γ的活性，而干扰素γ能激活CD8+?T细胞的杀伤活性。综合所有的结果，我们认为联合治疗通过增加T细胞活性来提高抗肿瘤效应。

总之，我们的发现首次证实：树突状细胞疫苗联合抗CD137抗体能提高抗肾癌的效应。这为临床上治疗肾癌提供了一条新的思路，具有广泛的应用前景。

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Experimentalstudyofrenalcellcarcinomatreatedwithcombinationofdendriticcellvaccinewithanti-CD137antibody

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3
(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China； 2. Red Cross Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

R737.11

A

1672-0024(2012)04-0047-04

韦思明(1971- ),男,浙江杭州人，博士，副教授,副研究员。研究方向：泌尿外科学

浙江省钱江人才计划基金资助项目(文件号:浙人社发[2009]194号)；浙江省教育厅科学基金资助项目(编号:Y200805942)