H2S、NO在肠缺血-再灌注损伤大鼠血浆中的表达

黄惊鸿，卢根林，邓 勇

(1.义乌市中心医院，浙江 义乌 322000；2.青海大学附属医院，青海 西宁 810001)

·基础与临床研究·

H2S、NO在肠缺血-再灌注损伤大鼠血浆中的表达

黄惊鸿1，卢根林1，邓 勇2

(1.义乌市中心医院，浙江 义乌 322000；2.青海大学附属医院，青海 西宁 810001)

目的： 研究H2S、NO在大鼠肠缺血-再灌注损伤血浆中的表达。方法雄性Wistar大鼠24只，分为S(假手术)组、I(缺血-再灌注)组,N(缺血-再灌注+ NaHS)组，每组8只。N组在再灌注前10min静脉注射100μmol/kgNaHS后按1mg.kg-1.h-1持续静脉注射直到再灌注2h，S和I组静脉注射相同体积的生理盐水。留取血测定H2S、NO,电镜下观察回肠组织病理变化，RT-PCR检测回肠组织iNOSmRNA的表达,分光光度法测定回肠组织iNOS酶活性。结果N组H2S、NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性分别为(35.27±3.14)μmol/l、(70.30± 6.32)μmol/l、(0.511±0.029)、(1.724±0.087)U/mg protein,低于S组、高于I组(P<0.01)。H2S与NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性呈负相关(r=-0.771、-0.876、-0.831,P<0.01)。结论H2S下调iNOS基因的表达，减少NO合成和释放，对大鼠肠缺血再灌注损伤起保护作用。

缺血-再灌注损伤；回肠；硫化氢；一氧化氮

Abstract：[Objective] To investigate the expression of hydrogen sulfide and nitric oxide in the serum of rats with ischemia-reperfusion injury. [Method] Wistar rats were randomly divided into three groups (8 in each group): S (sham), I (ischemia-reperfusion), N (ischemia- reperfusion and sodium hydrosulfide). Rats in Group N were received sodium hydrosulfide (100μmol/kg bolus +1mg.kg-1.h-1 infusion) 10min prior to the onset of reperfusion, whereas rats in group S and I were received normal sodium of equal volume. Blood was used to detect hydrogen sulfide and nitric oxide. The iNOS activiy in small intestine were measured by spectrophotometry. Ileum morphology was studied by transmission electron microscope. Expression of iNOS mRNA was determined by RT-PCR. [Result] H2S, NO, iNOSmRNA and iNOS activity in group N was (35.27± 3.14)μmol/l, (70.30±6.32)μmol/l, (0.511±0.029), (1.724±0.087)U/mg protein respectively which was notably higher than that in group I, strikingly lower than that in group S (p<0.01). H2S negatively correlated with NO, iNOSmRNA, iNOS activity (r= -0.771, -0.876, -0.831, p<0.01). [Conclusion] H2S plays an important role in protecting ischemia-reperfusion injury of small intestine in rats by down-regulating iNOS gene and reducing NO production.

Keywords：ischemia-reperfusion injury; small intestine; hydrogen sulfide; nitric oxide

小肠缺血再灌注(Ischemia—Reperfusi0n，I/R)损伤可在坏死性小肠结肠炎、肠梗阻、肠扭转、肠系膜上动脉栓塞等多种急腹症中发生，亦是影响肠移植成败的重要病理过程。H2S是继NO和CO之后的第三气体信号分子，由胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-splitting enzyme, CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)催化L-半胱氨酸代谢产生[1-3]。NO是一种炎症因子[4-5]。H2S、NO在肠缺血-再灌注损伤大鼠血浆中的表达及其意义，国内外文献鲜见报道，现加以探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠(西安交通大学医学院动物中心提供，清洁级)；敏感硫电极和PXS-270离子计购于上海雷磁仪器厂， iNOS酶活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所， RT-PCR Kit 购于Takara公司，Trizol为Invitrogen公司产品，iNOS引物上游引物: 5’-GTGTTCCACCAGGAGATGTTG-3’下游引物: 5’-CTCCTGCCCGC TGAGTTCGTC - 3 ’，扩增片段为514bp；β-actin上游引物: 5’-GAGGCCCAGAGCAAGAG AGG-3’,下游引物: 5’-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3’,扩增片段为302bp,由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及分组 雄性Wistar大鼠24只，6周龄，体重(210±15)g，随机分为S (假手术)组、I(缺血-再灌注)组,N(缺血-再灌注+ NaHS)组，每组8只。N组在灌注前10min时静脉注射100μmol.kgNaHS后按1mg.kg-1.h-1输注直到再灌注2h，S和I组静脉注射相同体积的生理盐水，作用时间和持续时间均同N组[1-2]。S组仅行剖腹及游离肠系膜上动脉(SMA)，I 和N组剖腹、游离及钳夹肠系膜上动脉60min和再灌注120min，建立大鼠肠缺血-再灌注损伤模型。再灌注2h处死I 、N和S组大鼠，取血离心分离血浆，立即切取距回盲瓣 30cm 的回肠5cm，其中5cm 回肠DEPC水清洗肠内容物后置于冷冻管中，液氮中保存。

1.2.2 血浆H2S、NO的检测 敏感硫电极法[6]测定血浆H2S浓度，化学法测定血浆NO含量。

1.2.3 回肠组织病理学改变 透射电镜下观察线粒体变化，取1mm×1mm×1mm回肠组织，采用戊二醛-饿酸双重固定，超薄切片，醋酸铀染色，电镜下观察、拍片。

1.2.4 RT-PCR检测回肠组织iNOSmRNA的表达 Trizol一步法提取回肠黏膜总RNA，电泳见28s、18s条带，以2.5μg总RNA为模板，以Random Premier为引物进行逆转录反应合成cDNA。iNOS PCR的反应条件为：95℃预变性3min后，95℃ 变性10s、55℃退火10s、72℃延伸20s,40个循环，72℃ 延伸7min；取PCR产物10μl，用凝胶图像分析系统拍摄并分析结果。

1.2.5 回肠组织iNOS活性的测定 根据 iNOS试剂盒说明书制备10%回肠组织匀浆，考马斯亮兰法测定组织蛋白含量，然后测定组织 iNOS活性，采用721分光光度计在530 nm波长、1cm光径下测各管吸光度值(0D)，根据OD值计算iNOS活性(U/mg protein)。

2 结果

2.1 大鼠回肠病理改变

图1-2示：I组大鼠回肠粘膜腺上皮细胞线粒体水肿，嵴变短、减少；S组大鼠回肠粘膜腺上皮水肿程度较轻，线粒体改变明显好转。表明H2S对大鼠肠缺血再灌注损伤起保护作用。

图1 示I组透射电镜下回肠粘膜腺上皮细胞线粒体改变

图2 示S组透射电镜下回肠粘膜腺上皮细胞线粒体改变，(TEM×6000)

图3 示大鼠回肠组织中iNOSmRNA的表达M：DNA Marker；1： S组；2：I组；3：N组

2.2 大鼠血浆NO、H2S及回肠组织iNOSmRNA、iNOS酶活性的变化

表1及图3示：N组H2S、NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性显著低于S组、高于I组(P<0.01)，H2S与NO、iNOSmRNA、 iNOS酶活性呈负相关(r=-0.771、-0.876、-0.831,P<0.01)。

组别iNOSmRNAFiNOS酶活性(U/mgprotein)FNO(μmol/L)FH2S(μmol/L)FS0.284±0.0370.972±0.04948.43±7.6342.57±7.18I0.612±0.035*2.344±0.117*119.19±9.93*24.38±2.69*N0.511±0.029*△7.241.724±0.087*△8.6770.30±6.32*△11.235.27±3.14*△9.12

注：与S比较,*P<0.01;与I比较,△P<0.01

3 讨论

H2S是继NO和CO之后的第三个被确定的气体信号分子，由CSE和CBS催化L_半胱氨酸代谢产生[1-3]。本研究发现：S组血浆H2S为(42.57±7.18)μmol/L与Sodha NR报道的相一医院致[3]。肠黏膜对缺血缺氧尤为敏感，表现为广泛功能障碍、黏膜屏障的通透性增高、肠道细菌的移位、毒素吸收及远处器官的损伤，出现严重的临床症状和并发症，是反映小肠缺血再灌注损伤较直观的指标。本研究发现，I组大鼠回肠粘膜腺上皮细胞线粒体水肿，嵴变短、减少；S组大鼠回肠粘膜腺上皮水肿程度较轻，线粒体改变明显好转，表明H2S对大鼠肠缺血再灌注损伤起保护作用。

一氧化氮合酶存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞及神经细胞中，有3种亚型：在正常状态下表达的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。NO是一种炎症因子[4-5]。内源性NO可通过降低血管反应性、维持小肠的血液灌注、抗血小板和白细胞聚集，清除氧自由基、抑制脂质过氧化和改善微循环等多个环节发挥对小肠缺血-再灌注损伤的保护作用[7]。NO的过量生成将会损伤组织细胞：NO参与中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的毒性作用同时与O2结合生成过氧亚硝酸基，过氧亚硝酸基可直接或通过分解成许多小分子毒性物质损伤细胞，NO通过这些毒性作用可直接损伤细胞的DNA或作用细胞的凋亡信号通路或协同其他细胞因子诱导细胞凋亡，同时在凋亡细胞中，一氧化氮合酶mRNA表达明显增强，说明NO能够诱导凋亡[7]。本研究发现：肠缺血-再灌注损伤大鼠中iNOS基因上调，NO大量生成。H2S下调iNOS基因的表达，减少NO合成和释放，与Oh[8]研究结果相一致，对肠缺血-再灌注损伤起保护作用。

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The expression of hydrogen sulfide and nitric oxide in the serum of rats with ischemia-reperfusion injury

HUANG Jinghong1, LU Genlin1, DENG Yong2

(1. Yiwu Central Hospital, Zhejiang 322000, China；2. Qinghai University Affiliated Hospital, Qinghai 810001, China)

R656.7

A

1672-0024(2012)02-0040-03

黄惊鸿(1969-)，男，浙江义乌人，本科，副主任医师。研究方向：普通外科学