黄河三角洲泥质沉积区表层沉积物古菌分布特征

王 涛, 萨仁高娃, 李铁刚, 马学恩, 春 梅, 于心科

(1. 内蒙古农业大学 动物科学与医学学院, 内蒙古 呼和浩特 010018; 2. 中国科学院 海洋研究所, 海洋地质与环境重点实验室, 山东 青岛 266071)

随着人类对生命起源的不断探索, 占地球面积71%的海洋早已成为研究的热点。作为地球生态系统最为重要的组成部分, 它自身不仅含有各种丰富的资源, 而且在地球的碳循环和氧含量中也起着不可替代的作用。海洋生态环境独特, 具有盐度高, 深层海域高压、低温、低营养和光照强度变化大等特点,加之其他极端环境的存在, 生活在这一复杂环境中的海洋微生物为适应相应的环境条件, 在物种类型、代谢类型、功能基因组成和生态功能上就具有多样性。海洋微生物种类繁多, 据统计约 1×106～2×108种,迄今最多只了解了其总量的1%, 甚至更少[1]。

在科学研究手段的不断发展和改进过程中, 海洋生态学研究取得了很大的突破, 人们对海洋微生物的分布及多样性有了更加深刻的认识。20世纪90年代海洋浮游古菌的发现与确认改写了早期认为古菌只存在于极端环境的论断, 对于古菌的认识和研究, 都被大大地拓宽了。这三大发现更是被称为新近海洋生态学发展的三大里程碑[2-3]。

古菌(Archaea)于1977年被首次当作一种生命形态来看待, 当时它们只是作为细菌中一个独特的子分支(subset), 因而被称作为古细菌(Archaebacteria)。古菌与细菌虽同属于原核生物, 但因它们之间有明确的区别, 所以两者均有独立的世系——域(Domain)——古菌域和细菌域。但随着科学家们对古菌认识的加深, Woese于1990年正式提出了古菌、细菌、真核生物的三域分界学说[4]。古菌的自身的特性使其能够生存于海洋的极端环境以及超微型浮游生物中, 而超微型浮游生物又被广泛认为是海洋环境的重要组成部分, 因此, 古菌在地球生态环境中的地位十分重要[5-7]。

随着现代分子生物学的不断发展, 许多创新方法与技术被广泛应用于古菌研究领域, 对古菌的系统分类、多样性等研究起到了巨大的推动作用。在研究古菌的分子生物学方法中, 16S rDNA文库分析是最为常用方法之一: 16S rDNA分子大小适中, 在分子生物技术上易于操作, 大量已知微生物的 DNA及16S rDNA序列都被测定并输入国际基因数据库,研究结果易于参照比较; 由于 rDNA 有高度的保守性, 通过比较各类原核生物的基因序列的差异, 可以绘制各类原核生物的系统进化树, 以了解生物在系统发育上的亲缘关系。目前, 16S rDNA文库分析技术已经成为微生物生态研究领域最重要的研究手段[8], 特别是对于大多数难以培养的古菌具有深刻意义。

目前国内对古菌的研究主要集中在海洋极端环境和一些能培养的类群上, 而古菌分布的广泛性研究偏少, 且目前调查手段普遍采用传统方法, 调查区域过小, 具有一定的局限性。本文古菌16S rDNA基因文库技术, 试研究黄河三角洲的泥质沉积区表层沉积物中古菌的群落特征及其与周围环境的联系,为今后在黄河三角洲及黄海区域开展古菌生态学研究提供了数据信息, 特别是在当前古菌研究主要集中在深海区域的背景下, 对相应的近海区域古菌研究也具有一定的参考意义。

1 材料及方法

1.1 样品来源及采集

本文的研究材料来自黄河三角洲近海岸泥质区,6个基因文库的采样区域沿山东半岛展开(HSZ-P:36°57.43'N, 123°99.91'E; HSZ-Q: 38°14.70'N,122°89.47'E; HSZ-R: 38°23.69'N, 122°19.03'E;HSZ-W: 37°63.93 N,121°80.83'E; HSZ-S: 35°47.57' N,120°41.95'E; HSZ-T:36°80.10'N,122°70.08'E), 表 层沉积物是由中国科学院科学三号于2009年7月的黄、渤海公益调查活动中借助表层沉积物采样器采集。样品采集过程均在无菌条件下进行, 采集完毕后,将样品装入无菌袋中, 保存于–20℃下, 返航后, 将样品存放于–80℃。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取

本研究采用土壤 DNA快速提取试剂盒(FastDNA Spin Kit for Soil, QBIOgene, USA)及Fast PrepPTMFP120(Thermo Electron Corp,USA)核酸提取仪对 6个不同站位的泥样沉积物进行提取。提取实验完毕后, 取适量基因组 DNA用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 以确认是否提取成功。将得到的DNA溶液用不同的离心管进行分装, 以免在实验过程中被全部污染。将后续实验使用的样品保存于–20℃, 其余样品存放于–80℃。

1.2.2 PCR技术扩增

PCR 扩增体系为 100 μmol/L dN TP、1.5 μmol/L MgCl2、1×Taq buffer、0.1 μmol/L 引物、2～5 μL基因组 DNA 作为 PCR 模板、32 ng/μLBSA(Sig2ma)、1.5 U Taq DNA聚合酶(MBI, USA), 反应体系终体积为12.5 μL。为了获得目的片段, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成了两条扩增古菌16S rDNA 部分片段的通用引物:

Arch21F (TTCCGGTTGATCCYGCCGGA)和Arch 958R (YCCGCGTTGAMTCCAATT)[12]。其中, Y和M为可变碱基, 其中, Y为C或T, M为A或C。PCR反应条件为: 94℃预变性5 min, 变性95℃ 30 s,复性55℃ 30 s, 延伸72℃ 90 s, 30个循环, 最后72℃再延伸10 min。完成后进行凝胶电泳检测, 根据电泳图选取合适梯度进行平行样扩增。

1.2.3 基因文库构建

将扩增产物经胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)进行纯化, 采用 TaKaRa公司生产的pMD19-T载体进行产物连接, 置于4℃, 6～8 h, 可过夜。将连接产物转化于感受态细胞内, 用不同浓度涂在带有Amp抗性LB板上于37℃恒温培养箱中培养12～16 h, 初筛阳性克隆。利用水煮法快速提取细胞中的基因组DNA[9]。更换反应体系中的引物, 相应换为 pMD19-T 载体引物: RV-M (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和 M13-D (5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′), PCR 反应条件相应改为:94℃预变性 5 min, 94℃变性 45 s, 58℃复性 60 s,72℃延伸80 s, 30个循环, 最后72℃延伸10 min。

1.2.4 基因文库的RLFP分析

将筛选好的阳性克隆产物用MspI 和HhaI(MBI, USA)两种限制性内切酶进行双酶切。酶切反应需在37℃下进行12～13 h。其产物用3%的琼脂糖凝胶(Akeaibao, Spain)进行电泳, 用 ImageMaster VDS凝胶成像系统 (Pharmacia Biotech, USA)凝胶成像后, 根据凝胶图像划分不同的RFLP带型, 选取相对应无重复的阳性克隆进行DNA测序。

1.3 系统进化及统计学分析

1.3.1 系统进化分析

将测序后的所有古菌 16S rDNA 序列按库分别提交到在线杂合子检测程序, 检测其是否为杂合子序列 ( http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)。非杂合子序列在 NCBI GenBank数据库中应用BLASTN 程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对, 找到最相似序列, 为构建系统进化树做准备。

1.3.2 统计学分析

基因文库中多样性覆盖率C(%)的统计结果由公式C(%)＝[1－(n/N)]×100 计算得出, 其中n指每个16S rDNA文库中只包含一个克隆的OTUs数, 而N指每个基因文库的克隆总数[10]。根据 DOTUR结果计算各个基因文库的香农-威纳(Shannon-Wiener)(H′)、辛普森(Simpson)(D)和均匀度(J′)等多样性指数[11]。将 rarefaction数据处理后绘制 6个基因库的稀释度曲线和数据统计图表以得到更清晰的结果。

1.4 在GenBank注册16S rDNA序列

本研究所测 113个 16S rDNA 序列已提交到GenBank, 注册号为: HQ267235-HQ267347, NCBI研究人员通过检测系统认为本次研究提交的 116个序列中有 3个不符合其认定, 故数量上较统计数据少3个。

2 结果

2.1 古菌16S rDNA文库分析

本次研究选择了 6个不同站位的表层沉积物芯样来构建16S rDNA文库。共筛选出568个阳性克隆,得到了116个RFLP带型(已除去杂合子)。经过测序处理, 用DOTUR软件进行3%的cut off后, OUTs总数为77个。经计算, 6个基因文库的样品覆盖率普遍较高(介于83%～93%之间, 表1)。综合6个基因文库的比较发现, 文库HSZ-P(Z2)统计的覆盖率较低, 而其H′,D及J′综合相比均较高(表1), 这些信息结合稀释度曲线能有效地表明该站位的古菌多样性相对于其他 5个站位是较高的。文库 HSZK-T(Z8)具有较高的覆盖率,H′,D,J′(表1), 表明该站位的古菌多样性相对较低。如6个古菌基因文库的稀释曲线所示(图 1), 当各文库克隆数渐近于 100时, 稀释曲线逐渐趋于平缓, 说明本研究建立的16S rRNA文库能够反映古菌群落的基本结构。

图1 古菌16S rDNA克隆文库稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curves of archaeal 16S rDNA clones

表1 古菌16S rDNA克隆文库分析Tab. 1 Analyses of the archaeal 16S rDNA clones libraries

2.2 古菌16S rDNA序列分析

研究中所有古菌 16S rDNA 序列均来自两个大类: 泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota),其中97.2 %为泉古菌(图2)。泉古菌又分为3个类群:主要为Marine Crenarchaeotic Group I(MGI)(88.8%),仅少量 Miscellaneous Crenarchaeotic Group (MCG)(7.3%)和 MarineBent hic Group B (MBGB)(1.1%)(图2); 广古菌(2.8%)分为两个类群: 分别是, Terrestrial Miscellaneous Euryarchaeotic Group(TMEG)(2.3%)和Marine Benthic Group D(MBGD)(0.5%)(图 2)。

综合6个基因文库进行比较, 我们可以发现, 随着样品采集地点(HSZ-T—HSZ-R)离海岸由近至远,古菌种类有渐增的趋势, 相应地, 其他菌类在各基因文库所占比重也相对明显增大(图2)。本次研究共构建了6个16S rDNA文库, 其中60个OTUs(代表505个克隆)均属于 MGI, 可见无论在数量还是多样性上, MGI均广泛分布于6个不同的16S rDNA文库中, 并占有绝对的比重(表2)。MGI最早发现于海水中[12], 是海水中古菌的主要类群[13-15], 也广泛分布于沉积物中。本次研究中的MGI的同源序列多来自与韩国济州岛边缘海域、美国江河流域以及太平洋浅海沉积物, 个别序列会对上深海区域, 如鄂霍次克海冷泉环境(图3)。

图2 沉积物中古菌群落的多样性分析及其在各文库中的分布情况Fig. 2 Diversity and distribution of archaeal communities in surface sediments

表2 古菌16S rDNA文库克隆系统发育归属关系Tab. 2 Phylogenetic affiliations of archaeal 16S rDNA clone libraries

泉古菌中, MCG在6个站位均有分布。MCG广泛存在于多种陆地和海洋环境, 在海水和沉积物中均有大量分布[16-17,23]。MBGB也称Deep-Sea Archaeal Group(DSAG), 最早发现于深海沉积物和热液口环境中[16], 是鄂霍次克海近岸黏土沉积物中的优势类群[17]。随着研究手段不断发展, 发现该类群也广泛分布于多种深海环境, 如大西洋深海沉积物、海底泥火山、黑海碳酸盐壳、贫有机物的深海海盆以及大陆边缘有机物富含甲烷或甲烷水合物的沉积物, 是秘鲁边缘 1230站位甲烷-硫酸盐转换带中古菌的优势类群[19-21,22]。在本研究中 MBGB分布并不广泛, 只在HSZ-P(Z2)和HSZ-Q(Z3)检测到, 数量很少。

TMEG广泛分布于陆地和淡水环境, 在海底沉积物中也有分布, 如秘鲁边缘1231站位[19,23]。TMEG在除了 HSZ-R(Z4)的其他站位均有分布, 且在基因文库中的数量也仅次于MGI和MCG。其同源序列(相似度 97%～99%)分别来自于江河流域以及鄂霍次克海, 两者的共同点是均来自于沉积物中。MBGD: 也称 MG-III (Marine Group III), 是热原体目(Thermoplasmatales)中的一个重要进化分枝。MBGD最初发现于大西洋陆坡和新英格兰离岸深海平原[18,22]。该类群古菌可能仅生活于深海沉积物中,在海水及近岸的沉积物中极少发现。本次研究中,离海岸相对较近的站位中均没有检测到 MBGD的存在, 且 MBGD的分布范围较小, 其数量也为最少,在 568个克隆中, 仅仅检测到 3个克隆序列属于MBGD(表 2)。

3 讨论

本文以黄河三角洲泥质沉积区 6个不同站位的表层沉积物中的的古菌作为研究对象, 应用成熟的16S rDNA序列分析技术, 结合传统的统计学分析和系统进化分析, 对获得DNA序列进行处理统计。由于绝大部分古菌的不可培养性, 采用这些非培养技术能够较好地评估沉积样品中古菌的多样性。测序后, 通过与网上序列的同源比对构建系统进化树,可以较为准确的地反应样品采集区域的古菌种类及其分布情况。尽管分子生物学方法也有其缺点(如:样品总DNA的提取效率偏差; PCR过程中产生的偏差; 挑取克隆的随机性), 但这些方法已经是绕过传统培养对特定区域进行目的性研究的最佳手段。

图3 黄海沉积物中古菌16S rRNA基因序列系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of the archaeal 16S rRNA gene sequences recovered from the Yellow River

为了更加准确地研究古菌的多样性, 还采用传统的统计学方法如香农威纳、辛普森等多样性指数以及绘制系统进化树进行分析, 结果表明研究区域中6个站位的古菌多样性较低, 仅检测到5种类群。MGI 这种常见古菌为研究区域的优势菌群, 且在各个基因文库分布较为均匀, 克隆数随着采样站位离海岸距离的拉大而相对减少。MCG为该次研究的第二大古菌类群, 其各个文库的分布与MGI基本相似,而这两类古菌是海洋中分布范围最广的类群。在本次研究中, 广古菌的克隆数仅占总克隆数的 3.7%,TMEG是其优势菌群, 并在5个文库中有分布。究其原因, 推断认为沉积物中的古菌群落结构可能受海域和菌群自身的适应性所影响。就表层而言, 其具有沉积时间较晚和沉积于浅表等特点, 且由于研究区域处于黄河入海口附近, 沉积物的迁移沉积过程中,一些河口的古菌也随之迁移沉积, 并逐渐适应新迁移的环境[24], 以致研究结果与本实验室以前的深海古菌研究有较大差异(古菌种类与深海相比较少, 多样性偏低), 从而间接证明了表层沉积物中微生物的群落结构异于深层沉积物。也有研究表明近海沉积物中微生物群落相当稳定, 受季节变化的影响很小,这种相对稳定是因为优势群落在全年普遍存在, 且比例很大[25-26]。

通过网上比对, 发现本次研究中16S rDNA序列与其在GenBank中的同源序列的相似度基本在90%以上(介于 93%～99%)。为进一步减小古菌归类的误差, 应用 Dotur软件处理序列后得到确切 OUT数,发现研究区域古菌的同源序列多来自于韩国济州岛附近海域、河口流域以及太平洋海域的表层沉积物。

综合对16S rDNA进行分析后发现, 来源于黄海近海岸表层沉积物的古菌序列主要出自于泉古菌,它的克隆数为总克隆数的96.3%, 且以MGI为主(占总克隆数的 88.8%)。MGI是海水中古菌的主要类群[14,15], 也广泛分布于沉积物中。本研究古菌均来自于沉积样品中, 也间接佐证了类似观点。有研究表明,MGI中的某些类群参与氨氧化过程, 在海洋氮的生物地球化学循环中起着主要的作用[27]。山东半岛河海入海口众多, 大量泥质沉积物被冲刷入海; 加之人类活动的污染, 导致黄海近海海域氮富集, 推测这可能也是 MGI菌类偏多的一大因素。MCG也是本次研究的主要古菌类群之一, 广泛存在于多种陆地和海洋环境, 是秘鲁边缘1227和1229站位、鄂霍次克海近岸火山灰沉积物以及 Nankai 海槽等环境中古菌的优势菌群[17,28]。本次研究所获得的古菌种类均来自于泉古菌和广古菌, 有报道指出, 海洋中古菌主要为泉古菌, 仅有小部分广古菌[15]。对比以往深海古菌研究结果, 本次研究中泉古菌所占比重相较广古菌更大; 从古菌多样性上来说相对偏少。古菌的同源序列多来自于江河流域, 以及沉积物当中;部分古菌因采样地点原因, 与韩国济州岛海域古菌有很高的同源性; 此外, 有相当数量的同源序列是具有金属依赖性的——本次研究采样地点在山东半岛近海岸的黄海海域内, 由于处于江河入海口附近,自然环境复杂, 加之近海海域的金属污染, 故推测这一现象可能与该海域特征有极大关联。

虽然本次研究检测到的古菌种类偏少, 但还是可以认识到古菌这种生物类群的分布是及其广泛的,它并不是只能存在于极端的海洋环境中, 不论是不同层位的纵向分布上, 还是不同海域的横向分布上;不论是江河流域近, 还是深海冷泉热液, 我们都可以发现它的存在, 这种古老的生命形态长期存在并参与着海洋生理生化作用, 与海洋环境相互影响。

4 小结

通过对黄河三角洲泥质沉积区古菌的研究, 综合应用RFLP技术、16S rRNA基因文库技术以及统计学等方法进行分析, 发现山东半岛的黄海近海海域的古菌类群并不丰富, 本次研究只检测到包括MGI在内的 5种古菌类群, 与深海古菌有较高的多样性相比, 存在着明显差异。6个基因文库的对比也表明, 古菌类群在研究区域的横向分布上也没有显著的差异, 只是随着离海岸距离的拉大, 除 MGI外其他古菌的克隆数有所增加, 但个数相对总体克隆数而言并不算多, 这样的统计结果可能与环境、水深、沉积物的理化特征有关。此外, 通过网上序列比对和系统发育树的构建, 发现研究区域部分古菌的同源序列与甲烷厌氧氧化、金属依赖性古菌相似度很高, 这也可能反映了该区域的环境特征。这些研究结果不仅说明了黄河三角洲泥质区古菌垂向分布特征, 也为今后在黄海区域开展古菌生态学及相关环境研究提供了数据信息。

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