常用萃取剂提取福寿螺卵中类胡萝卜素的初步研究

杨叶欣，顾党恩，牟希东，宋红梅，徐 猛，李玺洋，罗建仁，胡隐昌

中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州510380

福寿螺Pomacea canaliculata Lamarck，又名苹果螺，隶属腹足纲中腹足目瓶螺科瓶螺属，原产于南美洲，为世界性入侵物种(Naylor，1996)。20世纪80年代初作为淡水养殖新品种引入我国，后因口味不佳没有市场，被大量丢弃于自然界。由于福寿螺对环境适应强、繁殖快，很快建立种群，并啃食为害水稻、茭白、白莲等重要农作物，给我国南方农业生产造成了巨大经济损失(许燎等，2008)。不同于其他水生动物，福寿螺将卵产出粘于水面上方，以此逃避水生动物的捕食，并用鲜红色作为警戒色(Albrecht et al.，1996;Estebenet ＆ Cazzaniga，1993;Estebenet＆ Martín，2002)。目前，仅有报道显示，热带火蚁Solenopsis geminate Fabr.可捕食福寿螺卵(Yusa，2001)。福寿螺繁殖力极强，在广州1只雌螺1年可产卵20.4块(约4352.4 粒)(李承龄，1995)。激光拉曼光谱分析福寿螺卵壳中除含有六方碳钙石外，还含有类胡萝卜素(张刚生和郝玉兰，2005)。对螺卵周液蛋白研究发现，99%的卵红蛋白类胡萝卜素为虾青素及其酯化物，每粒卵约含虾青素1.5 nmol(Dreon et al.，2004)。可见，福寿螺卵中含丰富的类胡萝卜素。目前，有关福寿螺的研究主要涉及生物学(潘颖瑛等，2008;尹绍武等，2000)、养殖(敖鑫如，1990;毛盛贤，1989)、危害防治(湛美容等，2008;闫小红等，2011)及作为饲料蛋白源(成丽萍，2009;周维官和覃国森，2008);对螺卵的研究也主要集中在生物学特征(黄鹏等，2010;谌江华等，2011)及理化性质(Christeller，2005;Ituarte et al.，2010)方面。因此，本研究采用6种常用萃取剂对福寿螺卵中类胡萝卜素含量进行初步研究，以期为福寿螺的综合防治和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 福寿螺卵

采集珠江水产研究所内池塘边上附着的当天新产的卵块，整块取下。

1.2 试剂

甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚均为分析纯。

1.3 仪器

Eppendorf离心机，UV-8000s双光束紫外可见光分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

1.4 试验方法

称取0.05 g福寿螺卵和0.01 g无水 Na2SO4(脱水)，取适量萃取液于研钵迅速研磨后置于离心管中定容至15 mL，4℃冰箱过夜提取。浸提后于离心机4000 r·min-1离心10 min，取上层清液测定。在300～800 nm波长范围内进行扫描，找出最大吸收峰所处的波长，在该波长下测定各组提取液的吸光值。

类胡萝卜素含量计算公式:S=AKV/EG

其中:S为类胡萝卜素含量(mg·kg-1)，A为吸光值，K为常数(104)，V为提取液体积(mL)，E为吸光系数(2500)，G为样品质量(g)。

1.5 数据分析

用Excel进行平均值和标准差计算，用SPSS15.0对数据进行方差分析和LSD多重比较。

2 结果与分析

福寿螺卵中的色素易溶于甲醇、无水乙醇和丙酮，不易溶于乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚。6种常用有机溶剂萃取福寿螺卵中总类胡萝卜素，在471～474 nm有最大吸收峰，本试验将测定波长设为472 nm。结果表明，甲醇、无水乙醇提取液中的类胡萝卜素含量无显著差异;二氯甲烷和石油醚提取液中的类胡萝卜素含量差异也不显著;其他各组间差异显著。甲醇、无水乙醇和丙酮3种极性较强的提取液中类胡萝卜素含量明显高于其他3种提取液(表1、2)。甲醇与乙醇提取的类胡萝卜素含量分别是丙酮提取液的1.49和1.34倍。

表1 不同提取液类胡萝卜素含量方差分析Table 1 ANOVA for total carotenoids content from different extracts

表2 不同提取液类胡萝卜素含量LSD多重比较Table 2 Multiple comparisons for total carotenoids content from different extracts mg·kg-1

3 讨论

类胡萝卜素是一类广泛存在的天然色素，具有清除自由基、抑制细胞增殖、防止细胞恶性转化、预防癌症等重要的生物学功能(赵文恩等，1998、2006)。迄今为止，人类在自然界中已发现600余种类胡萝卜素类化合物(Oliver，2000)。目前，类胡萝卜素的研究方法主要有分光光度法、薄层色谱法和高效液相色谱法等，分光光度法测定快速，成本低廉，是最常用的分析类胡萝卜素的方法(Piccaglia et al.，1998)。本研究结果表明，甲醇萃取率最高，而甲醇的极性也最大。可见，福寿螺卵中类胡萝卜素更易溶于极性较强的溶剂，且溶剂极性越大提取效率越高，与菊花 Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel花瓣(车越等，2011)和紫苏粕Perilla frutescens(L.)Britton(朱建飞等，2011)的研究结果一致，而与白果Ginkgo biloba L.(黄文等，2001)相反。根据“相似相溶”规律，含氧类的类胡萝卜素在极性强的有机溶剂中的饱和溶解度高，只由碳氢组成的类胡萝卜素在非极性有机试剂中的饱和溶解度高(惠柏棣，2005)。推测，福寿螺卵中类胡萝卜素中极性较强的含氧衍生物含量较高，Dreon et al.(2004)在研究中发现，卵红蛋白类胡萝卜素中99%为虾青素及其酯化物，因而具有强抗氧化能力。

本研究中，甲醇提取的福寿螺卵中类胡萝卜素含量为(83.23±12.60)mg·kg-1，高于番木瓜果肉(73.3 μg·g-1)(郭鹏飞，2009)、紫苏粕(0.04 mg·g-1)(朱建飞等，2011)和淫羊藿 Epimedium grandiflorum Morr.叶片(29.25 μg·g-1)(曾丽萍等，2011)，低于菊花花瓣(3.8 mg·g-1)(车越等，2011)和银杏渣(119.25 μg·g-1)(唐仕荣等，2009)。类胡萝卜素的提取率不仅与有机溶剂的种类相关，而且受提取方法、时间、温度、体积比、光照及提取次数等影响(刘云等，2009;马利华等，2007;颜少宾等，2011;曾丽萍等，2011)，因此，可以通过优化提取工艺来提高萃取率。

产于水面上方的福寿螺卵避开了水生动物的捕食，但面对更大的环境压力，如陆生动物捕食、阳光直射、干燥等。因此，在进化过程中福寿螺卵形成了一系列有效的防御对策，如卵中蛋白抑制因子可保护卵不被细菌侵袭(Christeller，2005)及其营养不被捕食者消化吸收(Dreon et al.，2010)，类胡萝卜素—卵红蛋白可抵抗阳光照射(Heras et al.，2007)，糖类化合物可抵御干燥(Ituarte et al.，2010)，可编码神经毒素(Heras et al.，2008)等，这样的繁殖策略为其入侵提供了有利条件，也为福寿螺防治和根除带来困难，因此，对福寿螺卵的合理开发利用，可以为福寿螺综合防治和利用开辟新思路。

敖鑫如.2011.福寿螺的生活习性及养殖试验.南昌大学学报:理科版，(2):30-34.

车越，王普，孙卫，戴思兰.2011.10种提取液对菊花花瓣中类胡萝卜素提取效率的影响.湖北农业科学，50(15):3152-3155.

谌江华，姚冬明，刘芳睿，陈若霞.2011.福寿螺卵和幼螺抗逆性的初步研究.浙江农业科学，(4):902-905.

郭鹏飞，胡长鹰.2009.番木瓜中类胡萝卜素的提取.中国调味品，34(1):95-99.

黄鹏，林兆里，徐金汉.2010.福寿螺卵期生物学特性.福建农林大学学报:自然科学版，39(1):25-29.

黄文，谢笔钧，付勇，刘红东，彭光华.2001.白果中类胡萝卜素的提取.江苏食品与发酵，(4):3-5.

惠柏棣.2005.类胡萝卜素化学及生物化学.北京:中国轻工业出版社.

李承龄.1995.福寿螺的生长速度和繁殖力试验.植物保护，21(4):12-14.

刘云，王保健，林亲雄，吴谋成.2009.油菜籽中天然类胡萝卜素的提取工艺研究.食品工业科技，30(2):234-236.

马利华，秦卫东，宋慧，葛剑.2007.不同提取方法对牛蒡中类胡萝卜素含量的影响.食品科技，(1):80-85.

毛盛贤.1989.福寿螺生态习性及在北京地区养殖的可行性.生物学通报，(3):36-40.

潘颖瑛，董胜张，俞晓平.2008.温度胁迫对福寿螺生长、摄食及存活的影响.植物保护学报，(3):239-244.

唐仕荣，宋慧，刘全德，潘志雨，张恩会.2009.银杏渣中类胡萝卜素的提取及柱层析研究.食品工业科技，30(5):245-247.

许燎原，赖朝晖，李军进，吴龙根，杨筠文，吴降星.2008.宁波市福寿螺的发生为害与防治技术研究.中国农技推广，(10):37-38.

颜少宾，张妤艳，马瑞娟，俞明亮.2011.杏果肉中类胡萝卜素的提取方法研究.江西农业学报，23(9):159-161.

闫小红，周兵，邹有，蒋平，许冬梅.2011.16种植物提取物对福寿螺杀螺效果的研究.广东农业科学，38(4):81-84.

尹绍武，颜亨梅，王洪全.2000.福寿螺的生物学研究.湖南师范大学自然科学学报，23(2):76-82.

曾丽萍，刘谊兰，王瑛.2011.淫羊藿叶片中类胡萝卜素的提取分析研究.时珍国医国药，22(2):319-321.

湛美容，张天才，李晶.2008.垫江县福寿螺发生及防治对策.河北渔业，(1):43-44，56.

张刚生，郝玉兰.2005.福寿螺卵壳的激光拉曼光谱分析.分析仪器，(2):27-29.

赵文恩，韩雅珊.1998.类胡萝卜素的生物学性质.生物学杂志，15(3):1-3.

赵文恩，康保珊，焦凤云.2006.类胡萝卜素的抗癌作用与基因表达的联系.生物学杂志，23(2):1-6.

朱建飞，赖川，唐春红.2011.紫苏粕中类胡萝卜素提取工艺参数的优化.湖南农业大学学报:自然科学版，37(6):689-692.

Albrecht E A，Carreno N B and Castro-Vazquez A.1996.A quantitative study of copulation and spawning in the South A-merican apple-snail，Pomacea canaliculata(Prosobranchia:Ampullariidae).Veliger，39:142-147.

Christeller J T.2005.Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability.FEBS Journal，272:5710-5722.

Dreon M S，Ituarte S and Heras H.2010.The role of the proteinase inhibitor ovorubin in apple snail eggs resembles plant embryo defense against predation.PLoS ONE，5:e15059.

Dreon M S，Schinella G，Heras H and Pollero R J.2004.Antioxidant defense system in the apple snail eggs，the role of ovorubin.Archives of Biochemistry and Biophysics，422:1-8.

Estebenet A L and Cazzaniga N J.1993.Egg variability and the reproductive strategy of Pomacea canaliculata(Gastropoda:Ampullariidae).APEX，8:129-138.

Estebenet A L and Martín P R.2002.Pomacea canaliculata(Gastropoda:Ampullariidae):life-history traits and their plasticity.Biocell，26:83-89.

Heras H，Dreon M S，Ituarte S and Pollero R J.2007.Egg carotenoproteins in neotropical Ampullariidae(Gastropoda:Arquitaenioglossa).Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，146:158-167.

Heras H，Frassa M V，Fernández P E，Galosi C M and Gimeno E J.2008.First egg protein with a neurotoxic effect on mice.Toxicon，52:481-488.

Ituarte S，Dreon M S，Pasquevich M Y，Fernandez P E and Heras H.2010.Carbohydrates and glycoforms of the major egg perivitellins from Pomacea apple snails(Architaenioglossa:Ampullariidae).Comparative Biochemistry and Physiology，Part B，157:66-72.

Naylor R.1996.Invasions in agriculture:assessing the cost of golden apple snail in Asia.A Journal of the Human Environment，25:443.

Oliver J and Palou A.2000.Chromatographic determination of carotenoids in foods.A Journal of Chromatography，881:543-555.

Piccaglia R，Marotti M and Grandi S.1998.Lutein and lutein ester content in different type of Tagetes patula and T.erecta.Industrial Crops and Products，8:45-51.

Yusa Y.2001.Predation on eggs of the apple snail Pomacea canaliculata(Gastropoda:Ampullariidae)by the fire ant Solenopsis geminata.Journal of Molluscan Studies，67:275-279.