海南岛象耳豆根结线虫的种类鉴定及其rDNA-ITS序列分析

符美英，芮 凯，肖彤斌，黄伟明，陈绵才

海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所，海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口571100

根结线虫Meloidogyne spp.是一类在经济上极为重要的植物专性寄生线虫，广泛分布于世界各地，在35°S与35°N之间的地区分布最多(汪来发等，2001)。目前已报道有90多个种，但Karssen et al.(1999)认为仅81个为有效种。根结线虫可寄生2000多种植物，是普遍且重要的农作物病原线虫，一般造成农作物减产10% ～20%，严重的达75%以上。

海南岛是我国唯一的热带陆海海域省份，气候条件优越，一年四季均适合农作物的生长。随着热带现代农业的产业化发展，农作物复种指数不断提高，根结线虫病发生与危害日趋严重，给农作物的产量和品质造成较大影响，已成为制约热带特色现代农业可持续发展的主要障碍因子。

在根结线虫的形态学分类中，会阴花纹一直被认为最具有应用价值(赵洪海，1999)。但由于一些种类个体间会阴花纹变异较大，如果仅凭此特征作为鉴定依据，可能导致鉴定误差(卓侃等，2008)。基于根结线虫同工酶特别是酯酶和苹果酸脱氢酶谱型的稳定性，将其应用于根结线虫分类鉴定已越来越受到植物线虫学者的重视和关注。近年来，分子生物学技术作为一种辅助手段也广泛应用于根结线虫的分类鉴定中。Powers et al.(1993)用PCR技术研究了南方根结线虫M.incongnita Kofoid et White等8种根结线虫的线粒体DNA(mtDNA)，得到了不同大小的扩增片段，一些不能区分的片段，则通过进一步酶切鉴定。ITS(intemal transeribed spacer region)是一个通用的遗传标记，被广泛应用于构建系统发育树、预测种群结构、评估种群进化过程，以及确定分类地位等方面。廖金铃(2001)对根结线虫核糖体DNA的ITS区进行研究，通过分析荧光AFLP片段和对18S DNA、ITS区、26S DNA进行扩增、克隆与测序，成功地鉴定出花生根结线虫M.arenaria(Neal)Chitwood、南方根结线虫、瓜哇根结线虫M.javanica Treub和最近描述的一个新种番禺根结线虫M.panyuensis Liao。

象耳豆根结线虫是一种重要的植物病原线虫，现已广泛分布于世界四大洲的热带亚热带地区，欧洲及地中海植物保护组织(EPPO)已将其列入检疫名单。我国当前仅在海南省和广东省发现该虫(卓侃等，2008)，且国内关于象耳豆根结线虫的报道也较少。据此，笔者试图运用形态学、酯酶表型和分子生物学方法对海南岛象耳豆根结线虫进行全面而准确的鉴定，并对其分子特征加以分析，旨在为今后开展进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试病原根结线虫采集于海南岛各主要农作物主产区，分别将单卵块接种于预先用消毒土培植的感病品种番茄根上，进行活体保存，待用。

1.2 形态学鉴定

1.2.1 雌虫主要形态特征观察 观察头部、尾部特征等，每个种群共观测20头。主要测计指标为体长、最大体宽、口针长、DGO(背食道腺开口至口针基部球的距离)、口针基部球高、口针基部球宽、中食道球长、中食道球宽。

1.2.2 2龄幼虫(J2)形态观察及测量 主要观察头部和尾部特征，每个种群共观测20头。测计指标除了1.2.1中涉及的指标外，还包括尾长、透明尾长和a值(体长/最大体宽)。

1.2.3 会阴花纹的制作与观察 用挑针在体视显微镜下解剖根结，每个种群挑取成熟雌虫20头移入硬塑料板上的清水滴中，修切后剔除杂物，并用清水清洗3次;然后将包含完整会阴花纹的角质膜转移到载玻片上，加盖玻片;干燥后在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并拍照。

1.3 同工酶分析

运用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行同工酶分析。电泳分析采用北京六一仪器厂生产的DYY-6B型电泳仪，7%分离胶和4%浓缩胶，每孔加入20头纯化培养的年轻雌虫酶提取物。酯酶染色参照胡凯基(1988)的方法。以已鉴定的爪哇根结线虫样本作为参照系。酯酶表型的命名按照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法。

1.4 DNA 的提取

参照万新龙等(2007)的方法稍做改进，用挑针将单头根结线虫雌虫从根结中挑出，放入200 μL的PCR管中，加入8 μL灭菌水，并用枪头将线虫虫体戳破，直至内含物溢出;再加入2 μL 5×裂解buffer(10 × PCR buffer与1000 μg·mL－1蛋白酶 K，按等体积比混合);将PCR管转移到－70℃冰箱中，冷冻30 min;将冷冻后的PCR管置于PCR仪中，65℃ 1 h，95℃ 10 min;掌上离心机瞬时离心后，取上清液用于PCR扩增或置于－20℃冰箱中备用。

1.5 mtDNA PCR 扩增

采用引物#C2F3(5'-GGTCAATGTCAGAAATTTGTGG-3')和#1108(5'-TACCTTTGACCAATCACGCT-3')对根结线虫mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列进行扩增(黄伟明等，2011)。反应总体系为25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大连宝生物)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反应参数:94℃预变性4 min;94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环;72℃延伸10 min。

取10 μL PCR产物在浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上检测所扩增片段的大小，用凝胶成像系统观察、拍照。

1.6 rDNA-ITS 序列扩增

采用Vrain et al.(1992)设计的18S和28S引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，其序列分别为:5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'和5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3'，对根结线虫的rDNA-ITS进行扩增。反应总体系为25 μL，引物各 1.0 μL，Perfectshot Ex Taq 12.5 μL(大连宝生物工程有限公司)，模板 DNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反应参数:94℃预变性4 min;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环;72℃延伸10 min。扩增片段大小的检测方法与1.5一致。

1.7 PCR产物的克隆、测序与比对分析

对获得的mtDNA和ITS条带进行回收，将纯化后的PCR产物与pGEM-T Easy Vector载体(Promega)于4℃下连接12 h以上后，采用热击法转化到E.coli DH5a感受态细胞中。在含有氨苄Ampicillin(100 mg·L－1)、IPTG(24 mg·L－1)和 X-gal(20 mg·L－1)的LB筛选平板上挑取单个白色菌落于含有氨苄(100 mg·L－1)的液体LB中摇菌过夜。采用质粒提取试剂盒(OMEGA)提取重组质粒DNA，经PCR鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克隆进行测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。采用MEGA软件包中的Neighbor-Joining聚类分析法对所测定的序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 观测值 通过显微镜观察，对采自海南岛的10个纯化种群进行初步的会阴花纹观察和形态学测量、比对。雌虫呈梨形或球形，无后端突;头区和颈区分界不明显，唇盘圆盘状;口针细，略向背面弯曲;基部球粗大。J2线形，头区与虫体有明显的分界线。初步鉴定为象耳豆根结线虫。详细测量数据见表1。

2.1.2 会阴花纹特征 10个根结线虫种群会阴花纹的主要特征较一致，主要表现在整体呈卵圆形到椭圆形，背弓较高，线纹较细、由平滑到波浪状，尾尖区环纹不规则，侧线不明显(图1)。与刘昊等(2005)描述的象耳豆根结线虫会阴花纹形态一致。

2.2 同工酶鉴定

对各种群年轻雌虫的酯酶进行电泳分析，并参照Esbenshade＆Triantaphyllou(1985)的方法分类，发现10个种群(表2)的酯酶谱型均为VS1-S1型，其中1SG和4HBJ种群的酯酶图谱见图2。结合形态学结果，进一步确认10个根结线虫种群均为象耳豆根结线虫。

表1 象耳豆根结线虫的形态学测量数据Table 1 Measure data for morphology of M.enterolobii

图1 象耳豆根结线虫会阴花纹Fig.1 Perineal patterns of M.enterolobii

表2 象耳豆根结线虫10个种群的酯酶谱型Table 2 Phenotypes of esterases for 10 different populations of M.enterolobii

图2 象耳豆根结线虫酯酶电泳图Fig.2 Phenotypes of esterases for M.enterolobii in comparison with M.javanica.

2.3 mtDNA-PCR 扩增结果

用引物#C2F3和#1108对表1中10个根结线虫种群mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列进行扩增，均可获得700 bp的条带(图3)。这与有关文献报道的象耳豆根结线虫一致。

2.4 rDNA-ITS-PCR 扩增结果

用引物18S和28S扩增rDNA的ITS区序列，10个根结线虫种群的ITS片段均为750 bp左右(图4)。

2.5 序列测定与分析

对4HBJ种群的mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列和rDNA-ITS区序列分别进行克隆与测序，得到大小为705和765 bp的片段，将测序结果与Gen-Bank中已有的DNA序列进行同源性比较。发现与4HBJ种群mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列同源性最高的是象耳豆根结线虫(GQ870255.1)，达100%。比对结果进一步证明4HBJ种群为象耳豆根结线虫。与4HBJ种群的rDNA-ITS区序列同源性最高的也是象耳豆根结线虫(JF309153.1)，为98%;而与南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫的同源性仅为88%左右(图5)。

图3 10个根结线虫种群mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列PCR扩增结果Fig.3 PCR amplified mtDNA between COⅡ and LRNA for 10 populations of root-knot nematodes

图4 10个根结线虫种群rDNA-ITS区序列PCR扩增结果Fig.4 PCR amplified results of rDNA-ITS for 10 populations of root-knot nematodes

图5 4HBJ种群rDNA-ITS区序列的聚类分析Fig.5 The clustering analysis of rDNA-ITS of 4HBJ population

3 讨论

本研究运用形态学、同工酶电泳和 mtDNAPCR技术相结合的方法，准确鉴定出海南岛农作物上的象耳豆根结线虫。杨宝君(1983)于海南省儋州市野生象耳豆树上发现象耳豆根结线虫并鉴定为新种。本研究首次于海南岛栽培的葫芦科蔬菜(苦瓜、丝瓜、南瓜、黄瓜、葫芦瓜)、辣椒和南药植物(海巴戟、沉香、丁香)上发现该线虫。

4HBJ种群mtDNA的COⅡ和LRNA基因间序列与Genbank上公布的象耳豆根结线虫(GQ870255.1)的同源性高达100%，可以确定该种群为象耳豆根结线虫。

常见根结线虫种类如南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的rDNA-ITS区差异很小，有报道认为这一分子特征不能用于常见根结线虫的种类鉴定。本研究发现，4HBJ种群的rDNA-ITS区序列与象耳豆根结线虫(JF309153.1)的同源性高达98%，而与南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的同源性仅为88%左右。这表明象耳豆根结线虫rDNA-ITS区序列测定比对可作为其鉴定的1种方法，也阐明了象耳豆根结线虫与其他常见根结线虫种类的遗传距离相对较远，对于进一步开展象耳豆根结线虫研究具有重要参考价值。

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