美洲斑潜蝇SS-PCR检测技术研究

张桂芬，刘万学，郭建英，吕志创，万方浩，申香菊中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京009;农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京0008;北京市顺义区植保植检站，北京000

美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard，属双翅目潜蝇科斑潜蝇属，是一种世界性检疫害虫。欧洲和地中海植物保护组织 (European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO)将其列为A2 类检疫性有害生物(http:∥www.eppo.org/);我国农业部于1995年将其列为进境地植物检疫潜在性害虫，并制定了美洲斑潜蝇“九五”监测治理规划(陈文龙和张润杰，2003)。美洲斑潜蝇为多食性害虫，寄主广泛，如仅在北京地区其寄主已涉及20科130多种植物(雷仲仁和王音，2005)。

美洲斑潜蝇原产于巴西，20世纪40年代以来陆续暴发于佛罗里达、夏威夷等地，70年代后又于大洋洲的一些岛屿和阿拉伯半岛南部地区发现该虫。多年来该虫随寄主植物及其他介质在世界范围内传播蔓延，现已在40多个国家和地区严重发生(EPPO/CABI，2011)。由于美洲斑潜蝇具有繁殖能力强，发育周期短，寄主范围广，能传播多种植物病毒，可在较短时间暴发成灾等特点，许多国家将其列为植物检疫一类危险性害虫(Deeming，1992;EPPO/CABI，2011;Zitter ＆ Tsai，1980)。我国于1994年初在海南省三亚市蔬菜上首次发现美洲斑潜蝇，同年底即在华南、华中等地普遍发生(问锦曾等，1996)，1997年蔓延至全国25个省/直辖市/自治区;到目前为止，该虫已广泛分布于我国29个省/直辖市/自治区，对瓜果、蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉造成严重危害，已成为我国农业生产上的一个突出问题(陈兵等，2002;范文中和王中武，2005;胡长效和苏新林，2003;雷仲仁和王音，2005;王军等，1999)。因此，加强对美洲斑潜蝇的检疫和监测成为维护我国对外贸易信誉，保障人民健康生活的必要前提。美洲斑潜蝇以卵和幼虫藏匿在寄主植物组织内，随切花、切条、带叶的瓜、果、豆、菜、其他寄主叶片以及盆景植物进行远距离传播;蛹随寄主植株土壤传播(EPPO/CABI，2011)。因此，要加强对美洲斑潜蝇的检疫与监测必需建立一套快速准确的分子检测技术。

目前，世界上的斑潜蝇属昆虫约有300种，但真正危害农作物的仅有23种(Parrella，1987)，我国已知有14种(杨龙龙，1995)。斑潜蝇属害虫体型较小(如美洲斑潜蝇成虫体长1.3 ～2.3 mm，卵0.2～0.3 mm)，且外部形态极为相似，卵、幼虫和蛹更难以从形态上加以区分(附录)。然而，检疫工作中截获的斑潜蝇多为卵、幼虫或蛹。通常斑潜蝇属害虫幼期阶段多因形态不稳定或特征不明显而难以鉴定分类，无法及时进行种类识别，为检疫工作带来诸多不便(陈萍等，2002;Frick，1952;Sasakawa，1961)，而分子生物学技术的发展与应用为检疫害虫的及时鉴定提供了快捷而准确的途径。本研究以重要检疫害虫美洲斑潜蝇为靶标，以我国菜田常见潜叶蝇类害虫，包括南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis Blanchard、三叶斑潜蝇Liriomyza trifolli Brugess、葱斑潜蝇Liriomyza chinensis Kato、豌豆潜叶蝇Phytomyza horticola Goureau等为参照，采用种特异性PCR(speciesspecific PCR，SS-PCR)进行快速鉴定技术的研究，旨在为有效阻截美洲斑潜蝇的进一步传播扩散，保障国家贸易信誉和农业生产安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

美洲斑潜蝇饲养于中国农业科学院植物保护研究所南区温室，寄主植物为菜豆Phaseolus vulgaris L.;南美斑潜蝇采自云南省昆明市呈贡县蔬菜生产基地，寄主植物为芹菜Apium graveolens L.;三叶斑潜蝇由华南农业大学资源环境学院昆虫生态研究室提供;葱斑潜蝇采自市售大葱Allium fistulosum L.，产地为山东省章丘市;豌豆潜叶蝇采自北京市密云县河南寨乡，寄主植物为二月兰Orychophragmus violaceus(L.)Schulz。

1.2 潜叶蝇总DNA的制备

参照王莉萍等(2007)和周志湘等(2007)的方法并稍加改动。取美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇和豌豆潜叶蝇各1头(粒)，置于滴有20 μL DNA 提取缓冲液(pH 8.0，0.05 mol Tris-HCl、0.001 mol EDTA、0.02 mol NaCl、1%SDS)的Parafilm膜上，用0.2 mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨匀浆，匀浆液用微量移液器移入1.5 mL离心管;然后用100 μL提取缓冲液分2次冲洗匀浆器，并移入同一离心管，混匀;向管中加入8 μL(20 mg·mL-1)蛋白酶K，充分混匀后，于60℃水浴1.5 h(中途混匀1次);然后沸水浴8 min，加入220 μL氯仿/异戊醇(v∶v=24∶1)抽提液，轻柔混匀数10次后，冰浴30 min;4 ℃、12000 r·min-1离心 20 min，取上清液，加入440 μL预冷无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30 min;4℃、12000 r·min-1离心15 min，弃去上清液。加入400 μL 75%预冷乙醇洗涤，4 ℃、12000 r·min-1离心 15 min，弃去上清液;然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30 min后每管加入30 μL超纯水(其中美洲斑潜蝇的蛹以及1～3龄幼虫以20 μL超纯水复溶，卵以10 μL超纯水复溶)，充分溶解后于-20℃保存备用。

1.3 美洲斑潜蝇SS-PCR引物的设计

在GenBank中调用已知的美洲斑潜蝇线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基I基因(mitochondrial DNA cytochrome oxidase I，mtDNA COⅠ)序列(GenBank 登录号为 EU219613)(Shang et al.，2008)，运用 Primer Premier 5软件将美洲斑潜蝇COⅠ序列与其近缘种南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇的COⅠ序列进行比较分析，选取美洲斑潜蝇与其他潜叶蝇类昆虫同源性最低的区段，根据该区段的碱基序列设计1对美洲斑潜蝇特异性引物LSCZE1/LSCZF1，上游引物碱基序列为TCGAGCAGAATTAGGACAT，下游引物碱基序列为ATTGAAGAAAGTGGAGGGT(上海生工生物工程技术服务有限公司协助合成)，引物扩增片段大小为294 bp。

1.4 SS-PCR引物的种特异性检验

分别以单头南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇的DNA为模板，美洲斑潜蝇为阳性对照，检验美洲斑潜蝇特异片段扩增引物LSCZE1/LSCZF1的种特异性。PCR反应体系为20 μL，其中超纯水 11.4 μL、10 × 缓冲液 2.0 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.4 μL、5 U·μL-1L Taq 聚合酶 0.2 μL(美国NEB 公司)、20 ng·μL-1上游引物和下游引物各 2.0 μL、模板DNA 2.0 μL。扩增程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40 个循环;最后72 ℃延伸5 min。扩增反应在ABI-9700 PCR基因扩增仪上运行。取5 μL PCR扩增产物在1.5%(重量)琼脂糖(amresco)凝胶上以80 V电泳(Bio-Rad Power-Pac Basic)分离 50 min，然后以 GelDoc Universal Hood II型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories)分析电泳结果。每个种类分别检测10头，并随机以其他2种型号(Bio-Rad iCycler和 ABI Veriti)的PCR仪进行验证。

1.5 SS-PCR引物对不同虫态的扩增效果以及最低检测阈值的测定

分别以提取的不同性别(雌性成虫、雄性成虫)与虫态(卵、1～3龄幼虫和蛹)的美洲斑潜蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，每种性别或虫态分别检测10头。此外，取单头雌性成虫原模板DNA溶液2 μL(即1/15头成虫)以2倍浓度递减梯度稀释至1/30720头成虫DNA，然后以不同浓度的成虫 DNA 模板(即 1/15、1/30、1/60、1/120、1/240、1/480、1/960、1/1920、1/3840、1/7680、1/15360、1/30720头成虫)进行最低检出阈值的测定，每个浓度共计检测10头。

2 结果与分析

2.1 美洲斑潜蝇SS-PCR引物的种特异性检验

以美洲斑潜蝇及其近缘种属潜叶蝇类昆虫的DNA为模板，以所设计的特异性引物LSCZE1/LSCZF1进行PCR扩增。检测结果显示，该引物只对美洲斑潜蝇具有扩增能力，对其他种类的潜叶蝇没有扩增能力，表明该引物为美洲斑潜蝇的特异性引物(图1)。

图1 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1对美洲斑潜蝇及其近缘种属潜叶蝇的PCR扩增结果Fig.1 Amplification pattern of mitochondrial DNA of L.sativae and its related leafminer species using SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

2.2 SS-PCR引物对美洲斑潜蝇不同虫态的扩增效果

以不同性别和虫态的美洲斑潜蝇DNA为模板，以SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1进行扩增，结果显示，不同性别与虫态的美洲斑潜蝇均能稳定扩增出294 bp的特异性片段(图2)。

2.3 SS-PCR引物对美洲斑潜蝇成虫的最低检测阈值

当将单头雌性成虫的DNA模板进行递减梯度稀释至1/3840头时，所有的个体均能扩增出特异性的靶标片段;当稀释为1/7680头时，仍有60%的个体可扩增出清晰的条带(图3)。

图2 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1对美洲斑潜蝇不同虫态和性别的PCR扩增结果Fig.2 Amplification pattern of mitochondrial DNA from different developmental stages and sexes of L.sativae using SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

图3 SS-PCR引物LSCZE1/LSCZF1对美洲斑潜蝇的最低检出阈值Fig.3 The detection efficiency for L.sativae，using a dilution series of mitochondrial DNA isolated from a single adult，using the specifically designed SS-PCR primers LSCZE1/LSCZF1

3 讨论

种类鉴定是害虫检疫的首要工作。目前，斑潜蝇属昆虫的识别主要依据成虫的形态特征(Sasakawa，1961;Shiao et al.，1991;Spencer，1986);成虫前各时期(卵、幼虫、蛹)的鉴定由于形态不稳定或特征不明显而无法实施(陈萍等，2002;Frick，1952;Sasakawa，1961)，通常的做法是将其进行室内饲养，待羽化后再做鉴定，不仅耗时长，而且常因标本数量少而使鉴定工作无法完成(邱一中等，2000)。因此，研究开发快速、简便、准确且适用于昆虫不同发育时期的害虫鉴定新技术，是有效阻止危险性害虫进一步传播扩散，增强检验检疫和检测监测能力的必要前提。

目前，以分子生物学技术进行检疫性害虫种类鉴定识别以及检测监测的研究时有报道并逐渐得以推广应用，其中RAPD(random amplification of polymorphic DNA)(邱一中等，2000;Çöl et al.，2006)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)(陈萍等，2002;Scheffer et al.，2001)、多重 PCR(mutiplex PCR)(Miura et al.，2004)以及DNA条形编码(DNA barcoding)(Scheffer et al.，2006)等技术均已用于斑潜蝇属害虫的鉴定研究，并取得良好成效。但是，RAPD标记技术对环境因子的变化较为敏感，扩增产物的可重复性相对较差，结果的可靠性低，因此目前已较少使用;RFLP技术由于所需DNA量大，步骤多，周期长，而且制备探针及检测中要用到放射性同位素，虽可利用非放射性同位素标记方法代替，但成本高，成功率低，因此影响了其推广使用。mtDNA COⅠ基因为多拷贝，母系遗传基因，既具有相对的保守性又有足够的变异性，进化速率比核DNA快，很少存在插入和缺失，检测灵敏度高，适用于种间鉴别(Hoelzel，1991;Hoy，1994)。基于 COⅠ基因的DNA条形编码技术尽管需要经过产物回收、纯化、测序以及序列比对等步骤，但目前已成为物种鉴定的新方法。SS-PCR技术由COⅠ标记技术转化而来，具有重现性强、谱带单一等优点，适宜于大规模快速检测分析。

本研究根据已知的美洲斑潜蝇mtDNA COⅠ基因序列，设计美洲斑潜蝇特异性引物1对，并通过SS-PCR技术证实该引物只对美洲斑潜蝇mtDNA具有扩增能力，对同域发生的其他种类的潜叶蝇类害虫，如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力;该技术体系不仅对美洲斑潜蝇的成虫具有良好的扩增效果，而且对单头1～3龄幼虫、蛹以及单粒卵也具有同样的扩增效果;同时，该技术体系还具有较强的灵敏性，其最低检出阈值为1/3840头成虫;对靶标序列的测序及Gen-Bank比对结果显示，该片段与美洲斑潜蝇的同源性为 100%(Shang et al.，2008;Yang et al.，2011)，而与其他双翅目昆虫的同源性均低于96%(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。此外，SS-PCR 分析技术操作简便快捷，缩短了通关时间，提高了工作效率。因此，该技术体系可以用于美洲斑潜蝇的检测鉴定工作，并在害虫检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。然而，由于我国菜田常见的潜叶蝇类害虫种类较多，本研究中SS-PCR引物的特异性仍有待进一步验证。

致谢:北京城市学院生物技术专业的袁波同学和长江大学农学院植物保护专业的陈婷婷同学协助完成部分试验，特表感谢!

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