河北省新乐市羊梨形虫分子检测

陈丽凤，张香斋，王秋悦，刘朋朋，王思伟，邹亚学

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

梨形虫病是一类经硬蜱传播，由梨形虫纲巴贝斯科或泰勒科原虫引起的血液原虫病的总称。迄今为止，全世界已记载的各种哺乳动物的巴贝斯虫有67种，泰勒虫有13种［1］。羊梨形虫病是世界性分布的严重危害养羊业发展的一类重要疾病。该病主要呈地方性流行，危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的羊发育迟缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给养羊业造成重大经济损失［2，3］。笔者对采自河北省石家庄地区新乐市某羊场的羊进行梨形虫检测，以便了解和掌握该地区羊自然感染梨形虫情况，为预防该病提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物 31只小尾寒羊，引自河北省新乐市某羊场。

1．1．2 主要试剂 PCR相关试剂，2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司);PCR所用引物，GoldViewTM核酸染料，DM2000，血液基因组提取试剂盒，由北京赛百盛生物技术有限责任公司提供与合成。

1．1．3 仪器设备 高压灭菌器(YXQ－LS－18SI，上海博迅实业有限公司)，超纯水纯化系统(Milli－Q Gradient，法国Millproe)，电子分析天平(YP601N，上海天平厂)，超级恒温水浴箱(601型，金坛市医疗仪器厂)，高速台式离心机(TGL－16G，上海安亭科学仪器厂)，可调微量移液器(0．5 ～10 μL，10 ～100 μL，100～1 000 μL，德国普兰德)，PCR 仪(Mastercycler gradient，德国 Eppendorf公司)，微波炉(MC－2480EGR，青岛海尔集团)，双稳定时电泳仪(DYY－6C型，北京六一仪器厂)，凝胶成像分析系统(BIO－BEST200E，美国SIM)。以上仪器设备均由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1．2 方法

1．2．1 血样采集 对新乐市小尾寒羊随机进行颈静脉抽血，采取血样31份，每份2 mL，分装入抗凝离心管，放入冰盒带回实验室，保存待检。

1．2．2 模板DNA制备 将采集的羊血液参照试剂盒说明书提取羊血液基因组DNA。

1．2．3 引物设计 羊梨形虫PCR检测引物名称及序列见表1。

1．2．4 巢式PCR反应体系 PCR反应体系总体积为20 μL，包括2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各0．5 μL，模板各1．0 μL，超纯水补足至20 μL。离心混匀后选择适当的反应条件在PCR扩增仪上进行扩增。

表1 羊梨形虫PCR检测引物名称及序列

1．2．5 反应参数

①羊梨形虫通用片段PCR反应参数 预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火60℃，40 s;延伸72 ℃，1 min，30 个循环;延伸72 ℃，7 min。

②尤氏泰勒虫PCR反应参数 预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火64℃，40 s;延伸72℃，40 s，30 个循环;延伸72 ℃，7 min。

③吕氏泰勒虫PCR反应参数 预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火50℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 个循环;延伸72 ℃，7 min。

④中华泰勒虫PCR反应参数 预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火62℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 个循环;延伸72 ℃，7 min。

⑤羊巴贝斯虫PCR反应参数 预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火55℃，40 s;延伸72℃，1 min，30 个循环;延伸72 ℃，7 min。

1．2．6 PCR反应 第一轮PCR:以DNA为模板，采用虫种通用引物进行扩增。第二轮PCR:以第一轮PCR扩增产物为模板，分别采用尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、羊巴贝斯虫引物，对第一轮PCR扩增的阳性样本进行扩增。

1．2．7 电泳检测 反应结束后取5 μL PCR扩增产物于质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外灯下观察结果并拍照。

2 结 果

本次试验共检测样本31份，其中样本Y15，Y19，Y22，Y28扩增出约800 bp特异性条带(图1，图2)。将此4个样本分别对尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、羊巴贝斯虫进行第二轮PCR检测，仅吕氏泰勒虫扩增出了约500 bp特异性条带(图3)。

图1 虫体通用基因扩增结果

图2 虫体通用基因扩增结果

图3 吕氏泰勒虫基因扩增结果

3 讨 论

羊梨形虫病是我国北方农区、半农牧区及半林半牧区绵羊、山羊的常发病之一。血清学调查显示，从每年3月份血清抗体水平阳性率开始上升，到5月份达到最高值68．2%，到 10 月份达到最低值 36．4%［4］。据调查，绵羊羔羊发病率为60．81%，病死率为81．48%;山羊羔羊发病率为40%，病死率为85．71%，给养羊业造成严重的损失［5］。

目前，我国已报道的羊的梨形虫有5个种，即吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种［6，7］。它们都能引起动物贫血和黄疸等临床症状，并且血涂片观察时泰勒虫之间以及巴贝斯虫之间的形态非常相似，常呈混合感染状态，不易进行区别，这就给梨形虫病的防控带来了一定的困难。随着现代分子生物学技术在这一领域的不断应用，解决了许多应用经典生物学技术难以证实或明确的问题，并为梨形虫病的防治提供了很多新的理论和手段，取得了巨大的成果。国际上，对梨形虫病的诊断方法已从血涂片检查、补体结合试验、间接荧光抗体，发展到了DNA探针、PCR和酶联免疫吸附试验等更快速、准确的检测方法。其中PCR技术被认为是当前诊断梨形虫最敏感的方法之一［8，9］。本次试验根据18S rRNA基因序列设计特异性引物对河北省新乐市的羊梨形虫进行检测，结果显示，31只羊有4只感染梨形虫，且均为吕氏泰勒虫，说明河北省新乐市羊梨形虫种类主要为吕氏泰勒虫，自然感染率较高(12．9%)，对梨形虫病的潜在威胁不容忽视。

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