河北省滦县牛梨形虫的分子检测

张香斋，陈丽凤，陈 娟，王秋悦，刘朋朋，石 芳，邹亚学

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

梨形虫病是一类经硬蜱传播，由梨形虫纲巴贝斯科或泰勒科原虫引起的血液原虫病的总称。迄今为止，全世界已记载的各种哺乳动物的巴贝斯虫有67种，泰勒虫有13种［1］。牛梨形虫病是世界性分布的严重危害养牛业发展的一类重要疾病，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。在我国已报道的病原有牛巴贝虫(Babesia bovis)、双芽巴贝虫(B．bigemina)、大巴贝虫(B．major)、卵形巴贝虫(B．ovata)、一种尚未命名的巴贝虫(B．sp．)［2］、环形泰勒虫(Theileria annulata)、瑟氏泰勒虫(T．sergenti)和中华泰勒虫(T．sinensis)［3］。牛梨形虫病的传播媒介蜱有3种:残缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)和微小牛蜱(Boophihismicrophis)。据FAO统计，世界上有80%的牛遭到蜱的侵袭，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，全球每年就高达70亿美元［4］。本试验应用PCR诊断技术，对采自河北省滦县某牛场的牛进行梨形虫检测，以便了解和分析该地区梨形虫自然感染状况，为更好地防治该病提供一些参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 牛血液 采自河北省滦县某牛场。

1．1．2 主要试剂及缓冲液配制 50 ×TAE:取 Tris碱242 g，冰乙酸57．1 mL，0．5 mol/L EDTA(pH 8．0)100 mL加入纯水定容至1 L，储存备用;蛋白酶K(德国Merck公司)、无水乙醇(天津市北方天医化学试剂厂)、琼脂糖(西班牙进口分装)。PCR相关试剂，2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)，引物(北京赛百盛生物技术有限责任公司)。DL2000(北京博润德生物科技发展中心)。

1．1．3 仪器设备 超级恒温水浴箱(601型、金坛市医疗仪器厂)、高速台式离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)、可调微量移液器(0．1 ～2．5，5 ～50，100 ～1 000 μL，德国普兰德)、梯度 PCR 仪(Mastercycler gradient，德国Eppendorf公司)、双稳定时电泳仪(DYY-6C型，北京六一仪器厂)、血液基因组小量提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，基本常规仪器等均由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1．2 试验方法

1．2．1 样本 从唐山滦县某牛场中抽检28头牛，静脉抽血，加肝素抗凝，分装入试管，放入冰盒带回实验室，保存待检。

1．2．2 模板DNA制备 使用血液基因组小量提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)按操作说明书操作。

1．2．3 引物设计 根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列合成THX-F1/THX-R1和THXF2/THX-R2两对引物;根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因序列，合成TSSH-F/TSSH-R引物对;根据文献已发表的巴贝斯虫18S rRNA基因序列［5，6］，合成BSHY-F/BSHY-R引物对，用于双芽巴贝斯虫18S rRNA基因的扩增;合成NBBS-F1/NBBS-R1和NBBS-F2/NBBS-R2两对引物对，用于其它巴贝斯虫18S rRNA基因的扩增，引物名称及序列见表1。以上梨形虫中仅环形泰勒虫为巢式PCR方法检测，其余虫种均为常规PCR方法检测。

1．2．4 PCR反应体系 PCR扩增均在20 μL反应体系中进行。该体系包括:2×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物各0．5 μL，模板各1．0 μL，超纯水补足至20 μL。离心混匀后选择适当的反应条件在PCR扩增仪上进行扩增。

表1 引物名称及序列

1．2．5 PCR 反应参数

(1)环形泰勒虫巢式PCR反应参数:第1轮PCR反应:预变性94℃，3 min;变性94℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，1 min，40个循环，最后延伸72℃，7 min。第2轮PCR反应(以第1轮PCR产物为模板):预变性94℃，3 min;变性94℃，1 min;退火55℃，1 min;延伸72℃，1 min，30个循环，最后延伸72℃，7 min。

(2)瑟氏泰勒虫PCR反应参数:预变性95℃，3 min;变性95℃，2 min;退火63℃，2 min;延伸72℃，2 min，30 个循环，最后延伸72 ℃，5 min。

(3)牛双芽巴贝斯虫PCR反应参数:预变性94℃，3 min;变性94℃，30 s;退火58．1℃，1 min;延伸72 ℃，1 min，32 个循环，最后延伸72 ℃，5 min。

(4)其他牛巴贝斯虫PCR反应参数:预变性95℃，3 min;变性95℃，2 min;退火63℃，2 min;延伸72℃，2 min;30个循环，最后延伸72℃，5min。

1．2．6 电泳检测 反应结束后取5 μL扩增产物于质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外灯下观察结果并拍照。

2 结果与分析

本试验检测的28个样本中，其中7个样本扩增出了约1 700 bp(图1，图2)特异性条带，双芽巴贝斯虫阳性样本7份，阳性率为25．00%;3个样本扩增出了约900 bp和1 300 bp两条特异性条带(图3，图4)，其他牛巴贝斯虫阳性样本3份，阳性率10．71%;而环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫均未检测到阳性样本。

图1 双芽巴贝斯虫18SrRNA基因扩增结果

图2 双芽巴贝斯虫18SrRNA基因扩增结果

图3 其他牛巴贝斯虫18SrRNA基因扩增结果

图4 其他牛巴贝斯虫18SrRNA基因扩增结果

3 讨 论

梨形虫病是一类必须通过硬蜱传播的家畜血液原虫病，侵袭牛的梨形虫主要是牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和牛泰勒虫［7］。我国疆域辽阔，地跨古北、东洋两大区，从寒温带到热带，自然条件复杂，许多地区存在着大量可作为本病传播媒介的硬蜱，因此我国家畜中梨形虫种类较多，对畜牧业的威胁很大。罗建勋等获得34个牛和羊的梨形虫不同地区分离株，并对病原进行了分类鉴定，结果共分离到牛羊梨形虫9种、21株，牛巴贝斯虫未定种1株，羊巴贝斯虫未定种7株，羊泰勒虫未定种5株［6］。双芽巴贝斯虫，分布较广，主要在南方各省;牛巴贝斯虫，发现于贵州、安徽、湖南、陕西及河北等地;卵形巴贝斯虫，发现于贵州、湖南、河南及吉林等地;环形泰勒虫，分布较广，主要在内蒙古及东北、西北各地;瑟氏泰勒虫，发现于贵州、吉林、辽宁、河北、河南、湖南、云南、陕西、甘肃及宁夏。

多年来，为了控制梨形虫病，世界各国均开展了大量的研究工作，20世纪80年代以后，随着现代分子生物学技术在这一领域的不断应用，解决了许多应用经典生物学技术难以证实或明确的问题，并为梨形虫病的防治提供了很多新的理论和手段，取得了巨大的成果。国际上，对梨形虫病的诊断方法己从血涂片检查、补体结合试验、间接荧光抗体发展到了DNA探针、PCR和酶联免疫吸附实验等更快速、准确的检测方法。Martin-Sanchez等［8］建立了巢式PCR技术，将采集自牛环形泰勒虫病不同流行地区的214份样品分别用血涂片显微镜检查、荧光抗体和PCR检测，结果阳性率分为62．26%，69．86%，78．04%。显然，PCR方法的检出率高于其它两种方法。本试验参考的GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列、牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因序列以及文献已发表的巴贝斯虫18S rRNA基因序列［9，10］合成的梨形虫特异引物，现已广泛用于种的鉴定和基因相关性的研究。本试验采用PCR技术，对河北省滦县某牛场采集的28份血样进行梨形虫检测，结果显示，牛总感染率为25%(7/28)，感染牛中均有双芽巴贝斯虫感染(7/28)，与其他牛巴贝斯虫混合感染率为10．71%，表明河北省滦县牛梨形虫的自然感染情况较为严重，应给予高度重视。

［1］蒋金书．动物原虫病学［M］．北京:中国农业大学出版社，2000．

［2］罗建勋，殷宏，刘光远，等．牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列比较研究［J］．畜牧兽医学报，2005，36(9):906-911．

［3］白启，刘光远，韩根凤，等．在我国新发现的一种牛的泰勒虫(Theilria)未定种［J］．中国兽医学报，1995，15(1):16-20．

［4］SAUER J R，MCSWAIN J L，BOWMAN A S，et al．Tick salivary gland physiology［J］．Annu Rev Entoml，1995，40:245-267．

［5］王修文，林桌臣，危粹凡．贵州牛的原虫初步调查与研究［J］．贵州畜牧兽医科技，1984(3):35-40．

［6］罗建勋，殷宏，刘光远，等．我国牛羊梨形虫病病原的收集与鉴定［J］．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24(增刊):48-53．

［7］杨茂生，吴位珩，廖梅，等．牛梨形虫病的诊断与防治［J］．中国兽医寄生虫病，2008，16(2):48-49．

［8］MARTIN-SANCHEZ J，VISERAS J，ADROHER F J，et al．Nested polymerase chain reaction for detection of Theileria annulata and comparison with conventional diagnostic techniques:its use in epidemiology studies［J］．Parasitology Research，1999，85(3):243-245．

［9］ALL SOPP M T，CAVALIER SMITH T，DE WAAL D T，et al．Phylogeny and evolution of the piroplasms［J］．Parasitol，1994，108:147-152．

［10］REDDY G R，CHAKRABARTI D，YOW ELL C A，et al．Sequence micro hetero geneity of the three small subunit ribosomal RNA genes of Babesia bigemina:expression in erythrocyte culture［J］．Nucleic Acids Res，1991，19(13):3 641-3 645．