桔皮中黄酮类物质提取工艺优化及抗氧化活性的研究

2012-10-10冯小强李小芳于芳琴

湖南农业科学 2012年21期

冯小强，李小芳，杨声，于芳琴

（1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水 741001；2.定西师范高等专科学校，甘肃定西 743000）

许多现代文明病与人体缺乏抗氧化营养物质有关，而补充抗氧化营养物质则有助于对这些疾病的预防治疗。因此寻找天然、安全、有效的抗氧化剂资源尤为重要。柑桔类水果所含有的人体保健物质，主要有类黄酮、单萜、香豆素、类胡萝卜素、类丙醇、吖啶酮、甘油糖脂质等。桔皮的主要成分是纤维素，富含柠檬苦素，能有效抑制癌细胞的生长。桔皮膳食纤维具有多种生理功能，其中清除自由基作用越来越受到研究者的关注。对于桔皮抗氧化活性的研究有所报道[1-6]，但是，桔皮中黄酮类物质提取工艺的优化以及对桔皮、桔络、桔籽中黄酮含量和抗氧化活性的差异研究还未见报道。本文研究了桔皮黄酮类物质提取工艺的优化，并对桔皮、桔籽、桔络中黄酮含量和抗氧化活性进行了比较，该研究为进一步有效利用这一宝贵的植物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜桔子购于天水师范学院华嵘超市，桔皮、桔籽、桔络在60℃烘干恒重并粉碎备用。721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；RE52-99旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 提取工艺优化

考察提取溶剂A（60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇），提取时间 B（1.5 h，2 h，2.5 h），提取温度 C（60℃，70℃，80℃），固液比 D（1∶10，1∶15，1∶20）等因素对黄酮类化合物提取效果的影响，进行L9（34）正交试验。

称取桔皮粉9份，依次为6.087 5、6.074 1、6.073 2、6.022 4、6.046 4、6.006 2、6.002 5、6.022 1、6.006 2 g，放入三口烧瓶中，依次加入60%、70%、80%的乙醇，设计正交试验，回流提取两次，提取液抽滤后浓缩，转移到9个小锥形瓶中备用。

1.3 芦丁标准的绘制

标准溶液的配制：精确称取29.6 mg芦丁标准品置于100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解，稀释至刻度即得0.296 mg/mL的标准溶液。

标准曲线绘制：精密量取芦丁标准液 1＃、2＃、3＃、4＃各0.25 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.15 mL摇匀，放置6 min，在各加入1 mol/L的氢氧化钠溶液2 mL，用95%乙醇稀释至刻度至10 mL，摇匀放置15 min，在510 nm测定吸光度值A（g），以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[7]。

1.4 总黄酮含量的测定

取0.25 mL桔皮提取液置于10 mL的试管中，各加入5%硝酸钠溶液0.15 mL摇匀，放置6 min，再加入10%的硝酸铝溶液各0.15 mL，摇匀，放置6 min，再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液2 mL，用无水乙醇稀释至刻度10 mL，摇匀放置15 min，在510 nm测定吸光度A[7]。根据标准曲线可以计算出样品中总黄酮的含量（以芦丁计），桔皮总黄酮的提取率计算如下：

提取率（%）=100×总黄酮的质量（以芦丁计）／桔皮粉的质量（干重）

1.5 对O2－·自由基的清除作用

取0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl缓冲液4.6 mL置于试管中，于25℃水浴预热20 min，加不同浓度供试液1.0 mL，10 mmol/L邻苯三酚0.4 mL，混匀，于25℃水浴4 min，加8 mmol/L HCl 0.1 mL终止反应，以pH=8.2的Tris-HCl缓冲液调零。在325 nm处测定吸光度Ax，模型对照组（A0）用溶剂代替供试液，考虑供试液本身的吸光度值，用溶剂代替邻苯三酚溶液作为样品对照组（Ay），每个浓度组平行测定3次，求其平均值，加样如表1所示。测定结果以清除率表示，计算公式：

清除率（%）=100×[A0－（Ax－AY）]/A0

1.6 对OH·的清除能力

清除羟自由基的能力是体外常用的评估抗氧化方法之一。试验采用了水杨酸捕获法，利用fenton体系产生羟自由基，加入水杨酸捕获，能在510 nm产生强吸收的有色物质，通过测定其吸光度来判断。取2 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 mL，6 mmol/L过氧化氢1 mL，6 mmol/L水杨酸1 mL，加入样品1 mL，静置30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测定吸光度，计算羟自由基的清除率。

清除率（%）＝100×[A0－（AX－AY）]/A0

式中：A0为以溶剂代替供试液的试剂空白管的吸光度；Ax为加了供试剂的吸光度，Ay为不加显色剂的供试液的本底光密度，是为了消除供试液本身颜色对试验结果的影响。

1.7 还原能力测定

还原能力的强弱可以反映药物的潜在抗氧化性能，是体外抗氧化的一个重要指标，本试验用的是铁氰化钾法。取2 mL的样品，加入2 mL的磷酸缓冲液（pH=6.6）和1%铁氰化钾溶液2 mL混匀，在50℃下保温20 min，加入10%的三氯乙酸溶液2 mL，震荡摇匀后取2 mL的混合液，加入2 mL去离子水和0.1%的三氯化铁溶液0.4 mL，静置10 min。用去离子水为空白，在700 nm下进行比色，吸光度的值越大说明还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

从表1中可以看出4个因素对浸提效果的影响。由极差分析可知，各因素对桔皮总黄酮提取率的影响顺序是：B>D>C>A，即回流时间>固液比>回流温度>乙醇浓度，回流时间对黄酮的提提取效果的影响达到显著的水平，RB=0.059 3，表示提取时间为1.5 h与2.5 h相比，提取结果要提高0.059 3。固液比对黄酮提取效果的影响也较大，RD=0.040 2，表示固液比1∶10与1∶15相比，提取效果提高0.040 2。本试验确定的较适提取组合为A1B1C1D1，即桔皮黄酮浸提法最佳提取条件为60%乙醇为提取溶剂，在60℃，固液比1∶10的条件下提取1.5 h，在上述工艺条件下黄酮得率为0.175 8%。

表1 正交试验设计及结果

2.2 桔皮、桔籽、桔络中黄酮含量

以芦丁的浓度为横坐标，以吸光值（OD）为纵坐标，得到线性方程为y=3.976 8 x－0.000 3，R2=0.999 9的标准曲线，利用该线性方程测得样品的吸光度，计算出样品中总黄酮的含量。桔籽、桔络的粉末质量分别为6.073 1 g和5.924 5 g，根据芦丁标准曲线绘制，桔籽、桔络的吸光值分别为0.30和0.66，浓度分别为0.754 4 mg/mL和1.609 4 mg/mL，计算出桔籽、桔络提取液中黄酮的含量分别为0.47%和0.97%。桔皮、桔籽、桔络中的黄酮含量分析发现，桔络的黄酮含量最高达0.97%，桔籽的次之，黄酮含量0.47%，桔皮中黄酮含量最低为0.18%。