Cry1Ab蛋白在黑腹果蝇体内的生物富集及对体内3种保护酶活性的影响

汪 洋，周 颖，田一星，王 智

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种能产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）的细菌。在过去30多年中，Bt制剂广泛成功地用于防治农业、林业、贮藏物害虫和环卫昆虫等[1-3]。有研究表明，Bt蛋白对靶标生物和非靶标生物均存在富集，但是并未对靶标产生影响[4-6]。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是生物学研究中最重要的模式生物之一，广泛应用于生物各个方面的研究[7]，Cry1Ab蛋白为Bt蛋白中的一种，目前尚未有与黑腹果蝇相关的Cry1Ab蛋白方面的报道。

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）对昆虫分解外源毒物、维持正常生理代谢起重要作用[8]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一种富含金属离子的生物活性蛋白质，广泛存在于各种生物体内，是不可缺少的氧自由基清除剂[9]。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），是体内清除H2O2和许多有机过氧化物的重要酶，GSH-Px活性是衡量机体抗氧化力的重要指标[10]。

该研究采用Cry1Ab培养基饲养黑腹果蝇，研究了其对Cry1Ab的富集情况，以及在Bt蛋白胁迫下对黑腹果蝇体内的乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的影响，以期揭示Bt蛋白对非靶标生物的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 Cry1Ab蛋白购自上海佑隆生物科技有限公司，黑腹果蝇由湖南农业大学遗传学实验室提供。

1.1.2 培养基 （1）正常培养基。A液：124 g白糖、12.4 g琼脂，加水900 mL；B液：玉米粉165 g加水100 mL。将煮沸的A液加入B液中，混匀后加入10 mL丙酸，分装到培养瓶中，待冷却后撒少量酵母粉。（2）Cry1Ab培养基：正常培养基分装前冷却到50℃时，加入含Cry1Ab的蒸馏水，使培养基中Cry1Ab含量为200 ng/mL。

1.2 方法

1.2.1 种蝇培养 将黑腹野生型果蝇培养在干燥、25℃的恒温箱中培养，保持湿度50%～70%。

1.2.2 Cry1Ab蛋白在果蝇体内的富集 取羽化8 h后的未交配的黑腹果蝇成虫，在乙醚麻醉下分开雌雄并随机挑选，并在正常培养基培养和Cry1Ab培养基中培养。接种后果蝇于恒温箱中（25±1℃、湿度60%～70%）培养。培养5、10、15 d后，分别将在正常培养基（对照组）和Cry1Ab培养基（试验组）上培养的果蝇用乙醚麻醉后备用，每个处理重复3次。

1.2.3 可溶性蛋白及Bt含量的测定 （1）可溶性蛋白测定：将果蝇在用冰浴中匀浆，在4℃、4 000 r/min下离心10 min，取上清液作为酶源。参照Bradford（1976）的方法[11]，用考马斯亮蓝 G-250 法测定各酶液中可溶性蛋白含量。（2）Bt含量的测定：采用上海佑隆生物科技有限公司的elisa试剂盒进行检测。

1.2.4 酶活力的测定 （1）AChE活力测定：参照高希武（1987）方法[12]。0.1 mL的酶液加0.7 mL 0.067 mol/L的PBS缓冲液，再加0.1 mL 80 mol/L的ATCh，30℃下反应 30 min，然后加入 0.3 mL 10 mol/L的毒扁豆碱和1.8 mL 0.01 mol/L DTNB。磷酸盐乙醇显色剂终止反应，于412 nm处测定OD值。每个处理重复3次。（2）SOD活力测定：采用南京建成生物工程研究所生产T-SOD试剂盒进行检测，每个处理重复3次。（3）GSH-Px活力测定：采用南京建成生物工程研究所生产T-SOD试剂盒进行检测，每个处理重复3次。

1.2.5 数据处理 采用Excel 2007软件进行数据处理，并用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据均以平均值±标准误（Mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 培养时间对果蝇体内Cry1Ab蛋白富集量的影响

从表1可知，在Cry1Ab培养基中培养1～10 d后，Cry1Ab蛋白在果蝇体内均具有富集效应，且随时间的增长而不断增加；在第10天时达到最大富集量，约为对照组培养基中的3.7倍；培养10～15 d时，果蝇体内的Cry1Ab蛋白含量下降，在第15天时，果蝇体内的Cry1Ab蛋白含量已经低于培养5 d时的果蝇体内的Cry1Ab蛋白含量，接近正常值，说明果蝇体内具有自我降解Cry1Ab蛋白的能力。

表1 不同培养时间果蝇体内Cry1Ab蛋白含量

2.2 培养时间对果蝇体内 AchE、SOD、GSH-Px酶活力的影响

从表2中可看出，对照组果蝇培养0～15 d，体内的AchE比较稳定，在含Cry1Ab蛋白的培养基中培养0～15 d的果蝇AchE活力均低于对照组的果蝇，且存在极显著性差异（P<0.01），表明Cry1Ab蛋白对果蝇产生了一定的毒害作用。Cry1Ab培养基中培养10 d时，AchE比活力最低，相当于对照的64%，此时Cry1Ab蛋白在果蝇体内富集量亦最大，表明Cry1Ab蛋白能够对果蝇的兴奋性起到抑制作用。

在Cry1Ab培养基中培养的果蝇，在10～15 d内SOD酶活力均低于对照组，且达到极显著水平差异（P<0.01），表明Cry1Ab蛋白在果蝇体内对果蝇的SOD酶产生了抑制作用。对照组果蝇在0～15 d内SOD酶存在上升的趋势，但是Cry1Ab蛋白培养基中的果蝇也在0～15 d内SOD酶存在上升的趋势。在第10天时，SOD酶活力和对照组差距最大，表明在第10天时Cry1Ab蛋白对SOD酶活力抑制性最强。对照组的果蝇GSH-Px在0～15 d内基本稳定。

表2 不同培养时间果蝇体内3种酶的酶比活力

在含Cry1Ab蛋白的培养基中培养的果蝇，GSH-Px活力在培养5、10、15 d时出现略微上升的趋势，但总体酶活力均低于对照组，表明果蝇体内的GSH-Px活力受到了一定的抑制。随着培养时间的延长，GSH-Px活力略微增加，可能是体内的一种自我保护机制所致。

3 讨论

抗虫转基因作物对非靶标生物的影响一直是国内外转基因作物生态安全性评价研究关注的焦点问题。该研究果蝇产生富集的结果与张志罡等[13]报道的Cry1Ab蛋白在稻纵卷叶螟中的富集的结果一致，也同陈茂等[14]研究的水稻-稻飞虱-拟水狼蛛食物链中非靶标生物拟水狼蛛存在富集的结果一致。研究中果蝇的Cry1Ab蛋白的富集存在最高富集量，与上述两者的研究结果一致。这就意味着Bt蛋白无论对于靶标和非靶标生物均可产生影响。但在该研究中，果蝇体内的3种保护酶的变化规律与张志罡报道的稻纵卷叶螟中相关酶类的变化规律不一致。这可能与张志罡等研究报道的稻纵卷叶螟是靶标生物，对Cry1Ab蛋白比较敏感，而果蝇是非靶标生物，其对Cry1Ab蛋白反应较靶标生物慢有关。一旦体内出现Cry1Ab蛋白，靶标生物体内的一些生物化学反应产生相应的解毒作用，解除对自身的毒杀作用。而果蝇虽然遭受到Cry1Ab蛋白的毒害作用后，体内的3种解毒酶AchE、SOD、GSH-Px均不同程度受到了抑制。研究中该抑制在10 d时达到最大值，此时Cry1Ab蛋白的富集量也是达到最大值。此外，果蝇体内的一些相关酶类需要一段时间来适应，从而发生相应的反应来消除这种蛋白的影响。培养之初，果蝇处于一种适应状态，酶类因受到Cry1Ab蛋白的毒害均处于抑制状态，但当抑制情况到达一定程度时，果蝇体内自我保护机制可能发生作用，恢复了酶类的活性，不断消除其对自身的影响，使得Cry1Ab蛋白含量出现了下降的趋势，从而达到保护自己的目的。

[1]欧阳立明，吴宏文，喻子牛.害虫对转Bt基因抗性的治理策略[J].植物保护学报，2001，28（2）：183-188.

[2]Kleter G A，Bhula R，Bodnaruk K，et al.Altered pesticide use on transgenic crops and the associated general impact from an environmental perspective[J].Pest Management Science，2007，63：1107-1115.

[3]修伟明，刘红梅，李 刚，等.转Bt基因抗虫玉米发展状况及对非靶标昆虫的影响[J].玉米科学，2009，17（4）：1-6.

[4]闫瑞红，白耀宇，程家安，等.Bt稻Cry1Ab蛋白的表达和降解及对采后季节土表灰橄榄长角跳虫发生的影响 [J].植物保护学报，2009，36（5）：431-436.

[5]徐艳聆，王振营，何康来，等.昆虫对Bt杀虫蛋白的抗性机制及治理策略[J].植物保护学报，2006，3（4）：437-443.

[6]周 静.Bt水稻对蜘蛛优势类群及其与猎物相关性的影响[J].安徽农业科学，2010，38（16）：8343-8344，8346.

[7]万永奇，谢 维.生命科学与人类疾病研究的重要模型——果蝇 [J].生命科学，2006，18（5）：425-429.

[8]Xu Y L，Wang Z Y，He KL，et al.Effects of transgenic Bt corn exp ressing Cry1Ab toxin on activities of some enzymes in larvae of the Asian corn borer，Ostrinia furnacalis （Guene）（Lepidoptera：Pyralidae）[J].Acta Entomologica Sinica，2006，49（4）：562-567.

[9]郭正松，陈崇羔.蜂产品中超氧化物歧化酶的研究进展和应用前景[J].蜜蜂杂志，2003，（8）：21-23.

[10]马 森.谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展[J].动物医学进展，2008，29（10）：53256.

[11]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Ana.Biochem，1976，72：248-254.

[12]高希武.Gorun等改进的Ellman胆碱酯酶活性测定方法介绍[J].昆虫知识，1987，24（4）：245-246.

[13]张志罡，孙继英，李 勇.Cry1Ab蛋白对稻纵卷叶螟幼虫体内三种保护酶活性的影响[J].生物技术通报，2011，（1）：148-152.

[14]陈 茂，叶恭银，卢新民.Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集[J].昆虫学报，2005，48（2）：208-213.