浅白隐球酵母产油工程菌液体深层发酵技术研究

吴开云，程俊文，李纪元，范正琪，陈东亮

（1.中国林业科学院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；2.浙江省林业科学院微生物研究所，浙江 杭州 311000）

微生物油脂（microbial oil）又称单细胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源，辅以无机盐生产出的油脂及另一些有商业价值脂质[1]。微生物油脂可作为食用油脂的有效补充，尤其在生产功能性油脂方面有优势，还可代替植物用以制取生物柴油，缓解全球能源危机。因此，开发微生物油脂这一新的油脂资源，具有深远意义。随着现代生物技术发展，人类已获得了很多具有高产油脂能力或富含稀有脂肪酸的产油微生物资源，并在提高微生物产油效率方面取得可喜的进展。微生物发酵生产油脂具有油脂含量高、生产成本低、生产周期短等优点，且可用细胞融合、细胞诱变等方法，使微生物产生富含某些特定脂肪酸（如EPA、DHA等）组分油脂[2-3]。

浅白隐球酵母（Cryptococcus albidus）具有营养要求简单、环境适应能力强、生长迅速及含油率高[4]等特点。深层发酵目前主要用于高附加值的医药、保健品工业发酵[5-6]，尚未见有关浅白隐球酵母产油脂深层发酵方面的研究。项目组在前期工作中，已经对1株高产油脂的浅白隐球酵母菌种进行了基因工程改造[7]，并在摇瓶发酵和实验室小型发酵罐中培养基的优化进行了初步探索。在此基础上开展了深层发酵中试，探索和优化其在深层发酵试验中的各项条件参数，以期为工业化发酵生产微生物油脂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 浅白隐球酵母菌种：基因工程改造菌株，中国林科院亚热带林业研究所提供，已转入千年桐SAD外源基因[7]。

1.1.2 主要试剂 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、蛋白胨、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸铵、亚硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、酵母膏、氯化钾、硫酸镁、无水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、硝酸铵及重铬酸钾等（国产化学纯）；植物油、马铃薯、玉米粉等均为市售、食品级。

1.1.3 主要仪器 AIR-TECH超净工作台（苏净集团安泰公司）；UV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；pHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）；GZX-9140 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；YXQLS-75S11立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SPX-150生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ZHWY-211B摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；Anke DL-4000B冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；10L机械搅拌发酵罐（镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）。

1.1.4 培养基 斜面保藏PDA培养基（g/L）：马铃薯块 200，葡萄糖20，琼脂15，加水至 1 L，121℃灭菌20 min。液体种子培养基（g/L）：葡萄糖25，（NH4）2SO43、KNO31、 酵 母 粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5。 摇瓶发酵基础培养基（g/L）：葡萄糖 30，（NH4）2SO43、KNO31、酵母粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，28℃、pH值自然，140 r/min培养。

1.2 方法

1.2.1 发酵罐发酵工艺条件研究 采用优化后的摇瓶发酵基础培养基配方在10 L发酵罐上进行发酵工艺条件试验研究。考察不同的搅拌速率、通气量、pH值控制方法等对浅白隐球酵母发酵生物量的影响，并进行验证试验。将摇瓶培养18 h的浅白隐球酵母液体菌种接入10 L发酵罐里，装量7.5 L，接种量 10%（v/v），罐压 0.03～0.05 MPa ，培养温度28℃，搅拌速度 250 r/min，通气量初始为 1∶0.6，进入对数生长期后调为1∶0.8，初始pH值为6，进入对数生长期后调节恒定为4.0。每12h取样一次，测定生物量进行验证。

1.2.2 分析检测项目及测定方法 （1）溶氧（DO）消耗：采用自动罐的溶氧电极进行测定，将培养基灭菌至保温结束阶段时溶氧定义为0，灭菌结束降温至发酵温度27℃，并向培养基中充分通气和搅拌至培养基内溶解氧达到饱和，此时将溶氧电极读数定位为100%。（2）pH值测定及其控制：采用发酵罐的pH电极进行测定。采用浓度为1 mol/L的HCl及2 mol/L的NaOH，通过流加方式进行pH值控制。

1.2.3 发酵生物量检测 将发酵培养摇瓶中的培养物在3 500 r/min下离心20 min，去除上清液，沉淀物用在60℃下烘至恒重，称重。重复3次，取平均值。

1.2.4 油脂检测 （1）油脂提取：利用酸热法提取油脂[8]。发酵液于6 000 r/min离心5 min，菌体沉淀按每克菌6 mL的比例加入4 mol/L盐酸，振荡混匀，室温放置30 min后，沸水浴5 min，-20℃速冷，加入2倍体积氯仿—甲醇（1∶1）提取液。充分振荡后，6 000 r/min离心5 min，取氯仿层，加等体积1 g/L氯化钠溶液，混匀，6 000 r/min离心5 min，取氯仿层，100 r/min 55℃真空旋转蒸发，除去氯仿即得油脂。根据所得油脂质量和发酵液体积计算油脂产量。（2）脂肪酸分析：采用氢氧化钾—甲醇室温酯化法，称取油脂或脂肪酸50 mg置于10 mL量瓶内，加入2 mL石油醚和苯的混合溶剂（1∶1），轻轻摇动使之溶解。再加入2 mL 0.4 mol/L氢氧化钾—甲醇溶液，混匀[9]。在室温下静置5～10 min，加蒸馏水使全部有机相甲酯溶液升至瓶颈上部。静置澄清后吸取上清液，所得清液即可用于气相色谱分析。气相色谱仪器检测委托“国家林业局经济林产品质量检验检测中心”完成。

2 结果与分析

2.1 发酵罐发酵工艺条件研究

2.1.1 搅拌速率对浅白隐球酵母发酵的影响 微生物在发酵过程中，搅拌对于菌体生长及其产物的生成非常重要，利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，提高发酵液的溶解氧，供给微生物生长繁殖代谢过程所需的氧。搅拌速率大，则通气及溶解氧情况好，传质快，有利于好氧菌的生长，但是过高的搅拌速率会增大对菌丝体的剪切力，不利于酵母菌的增殖，对于产物的合成也会造成影响。而搅拌速率小，溶氧情况不好，传质差，不利于菌体生长及其产物的形成。因此，合适的搅拌速率对于浅白隐球酵母的正常发酵很重要。从图1中可知，发酵罐的搅拌速率对浅白隐球酵母生物量影响不大，当搅拌速率为250 r/min时，浅白隐球酵母的干物质生物量达到最大。因此，在浅白隐球酵母的发酵试验中，采用搅拌速率为250 r/min时较合适。

2.1.2 通气量对浅白隐球酵母发酵的影响 通气量是影响发酵的另一个重要因素，它对溶解氧状况起决定性作用，通气量与溶氧系数成正比，不同的生成时期对溶氧要求不同。对于好氧菌而言，溶氧主要用于菌体呼吸代谢及其产物的合成。在发酵过程中通气量通常是以发酵液与通气量体积之比来表示的，为了确定浅白隐球酵母在10 L发酵罐中发酵的合适通气量，采用了 1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8 、1∶1（V/V·min）几个不同的通气量进行了试验。结果如图 2 所示，当通气量超过 1∶0.6（V/V·min）后，生物量增加不显著，综合考虑，初始通气量选为1∶0.6（V/V·min），后期适量增大较为合适。

2.1.3 pH值调控对浅白隐球酵母发酵的影响 如图3所示，pH值对菌体的生产及代谢产物的生产具有重要的调节作用，从试验结果可以发现，当初始pH值为6时，发酵生物量达到最大，这可能是在

发酵初期pH值为6时更适合浅白隐球酵母生长。

2.1.4 发酵罐工艺验证试验 如图4所示，浅白隐球酵母在上述发酵培养工艺条件下，当培养时间为60 h时，发酵生物量达到最大值，之后随着培养时间延长，菌丝发生自溶，其值有所下降。即当培养时间为60 h时，生物量达最高，为4.63 g/L，此时发酵生物转化率为12.34%。图5为发酵过程中期浅白隐球酵母菌丝显微照片，显示浅白隐球酵母在10 L液体发酵罐中菌丝生长状态良好。

2.2 脂肪酸组分分析

在优化条件下进行深层发酵，收集提取的油样进行甲酯化处理，采用气相色谱法测定浅白隐球酵母油脂样品，结果如图6所示，脂肪酸组分以油酸为主，其次是棕榈酸，而硬脂酸含量较低。这可能是菌株含有转入的千年桐SAD基因，表达了△9硬脂酰-ACP脱饱和酶，催化了硬脂酸在第9～10碳原子之间脱氢，促进硬脂酸向油酸转化的结果。

3 讨论与结论

在优化浅白隐球酵母摇瓶液体发酵培养基的基础上，对10 L发酵罐进行发酵工艺研究，其优化发酵条件为：发酵培养基（g/L）配方为葡萄糖30，（NH4）2SO43，KNO31，酵母粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5；装液量 7.5 L、接种量 10%（v/v）、罐压0.03～0.05 MPa、培养温度28℃和搅拌速度250 r/min；通气量初始为1∶0.6，进入对数生长期后调为1∶0.85；初始pH值为6，进入对数生长期后调节为4。搅拌速率为250 r/min时，剪切效应和溶氧效益达到适度的平衡，浅白隐球酵母的生物量达到最大；通气量达到 1∶0.6（V/V·min）时，生物量不再明显增加；当初始pH值为6时，生物量达到最大。此条件下培养60 h，发酵生物量最大，达4.63 g/L，此时发酵生物转化率为12.34%。

该试验是根据前期摇瓶试验的结果，选择葡萄糖作为深层发酵液体培养基中的主要碳源成分。鉴于在生产上大量使用葡萄糖存在成本高的问题，可以用淀粉糖化代替，但需要通过试验确定适合的添加量和添加方法。该研究是在中试规模的发酵体积下进行的，大规模容量的深层发酵试验有待进一步研究。考虑到农林副产品中有大量的木质纤维素资源[10-11]，如何利用木质纤维素作为浅白隐球酵母产油脂发酵的碳源，将具有重要的经济前景，并符合可持续发展的社会要求。

[1]董文宾，梁西爱，代春吉，等.微生物油脂及其新的应用研究[J].粮油加工与食品机械，2006，（3）：54-55.

[2]刘 波，孙 艳，刘永红，等.产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展[J].微生物学报，2005，45（1）：153-156.

[3]罗玉萍，杨荣英，陈 英，等.酵母油脂的脂肪酸组成的研究[J].中国粮油学报，1994，3（9）：44-48.

[4]薛飞燕，张 栩，谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程，2005，3（1）：23-27.

[5]李宇伟，连瑞丽，李利红，等.灵芝液体深层发酵菌株筛选与培养基优化的研究[J].广东农业科学，2010，（6）：52-55.

[6]刘冬华，刘 江，汪 彬，等.姬松茸液体深层发酵培养条件的研究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2007，33（4）：475-479.

[7]陈东亮，李纪元，范正琪，等.农杆菌介导SAD基因转化浅白隐球酵母的条件优化[J].湖南农业科学，2010，（7）：16-19.

[8]李植峰，张 玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究[J].微生物学通报，2001，28（6）：72-76.

[9]咸 漠，康亦廉，刘 延，等.菌油脂肪酸碱法甲酯化的研究[J].吉林大学学报（自然科学版），2001，（1）：103-105.

[10]李剑泉，侯建筠，李智勇.中国林业生物能源开发优势与发展机遇[J].林业科技，2010，35（1）：52-58.

[11]任天宝，张玲玲，宋安东，等.稻草秸秆多酶水解条件研究[J].可再生能源，2010，28（2）：67-71.