骨质疏松症脾肾两虚型病证结合动物模型的建立*

刘梅洁，李鸿泓，王少君，刘 红，于 峥，潘静华，赵宏艳，李 艳，付小卫，宋长恒，鞠大宏

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

中医理论认为，骨质疏松症的发生，肾虚是其根本原因，脾虚是主要因素之一，“脾肾相关”，两脏俱虚，可共同导致该病的发生。本研究以此为理论基础，开展了骨质疏松症脾肾两虚型病证结合动物模型的建立工作，并深入探讨机体在肾虚、脾虚和脾肾两虚状态下，骨量、骨吸收和骨形成的变化情况及存在的差异。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康雌性 SPF级 Wistar大鼠 72只，体重200g～220g，由中国药品生物制品检定所提供(许可证号SCXK(京)2009-0017)，在中日友好医院临床研究所动物室屏障系统(实验动物室许可证号SYXK(京)2010-0011)。

1.2 药物

己烯雌酚由合肥久联制药有限公司生产(批号20100120，每片1 mg)，使用时用蒸馏水制成浓度为0.0046 mg/mL的混悬液，给药体积为1 mL/100g体重，给药剂量为0.046 mg/kg体重。大黄浓煎液为川大黄水煎制，浓缩至200%。

1.3 试剂

戊巴比妥钠由美国 Sigma公司生产(批号20090305);盐酸四环素由美国 Amresco公司生产(批号20090301);甲基丙烯酸甲酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精细化学品有限公司生产(批号980716);聚乙二醇400由北京化学试剂公司生产(批号050425);苯甲酸甲酯有华北地区特种化学试剂开发中心(天津)生产(批号980923);过氧化苯甲酰由北京金龙化学试剂有限公司生产(批号20000420);N，N－二甲基对甲苯胺(N，N-Dimethylp-toluidine)由ALDRICH公司生产(批号04327MB-235)。Ⅰ液:100ml甲基丙烯酸甲酯+35ml甲基丙烯酸丁酯+5ml苯甲酸甲酯+1.2ml聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥过氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液 +0.8g干燥过氧化苯甲酰。

1.4 仪器

冷冻切片机:英国 TBS公司;Reicheit-Jung2040切片机:德国;LEICA CTR6000显微镜:德国 Leica公司;Leica-Qwin图像分析仪系统:德国 Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 动物分组、模型制作及处理 选用健康雌性Wistar大鼠72只，随机分为3组，其中正常对照组12只，假手术组12只，脾虚模型组12只，卵巢切除组36只。所有大鼠适应性喂养1周后，将卵巢切除组大鼠以45mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹位固定，行卵巢切除术［1］。假手术组只是切除小块脂肪组织，但不摘除卵巢。术后10周，将卵巢切除组大鼠随机分为肾虚模型组、脾肾两虚模型组及阳性对照组。脾虚模型组及脾肾两虚模型组大鼠用200%的大黄浓煎液灌胃，4ml/只，每日1次，连续14 d;同时其余各组大鼠胃饲等容积的蒸馏水。随后，阳性对照组大鼠灌胃给予己烯雌酚，每日1次，连续6d，休息1d，再连续给药6d，每周称重 1次，据此调整给药量。同时，脾虚模型组及脾肾两虚模型组大鼠给予200%的大黄浓煎液灌胃，每周2次，如此给药3个月。正常对照组、假手术组和肾虚模型组按同法灌服等体积的蒸馏水。

处死前16d和前3d分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。给药结束后，取大鼠右侧胫骨近端1/3制作不脱钙骨切片，进行骨组织形态计量学指标的检测。

1.5.2 不脱钙骨切片的制作 取大鼠右侧胫骨近端1/3，置于4%多聚甲醛溶液(PH7.4)中固定24h，然后进行脱水，程序为80%乙醇2d，95%乙醇2d，100%乙醇2d，二甲苯2d。接着，标本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d，以上固定、脱水和浸泡过程均在4℃进行。最后，将400μLN，N-二甲基对甲苯胺(N，N-Dimethyl-p-toluidine)加入到100ml预冷(4℃)Ⅲ液中，用磁力搅拌器搅拌10min后，在青霉素小瓶中注入约7ml的Ⅲ液，将骨标本按同一方向放入瓶底，用注射器抽空包埋瓶中空气，然后置于-20℃冰箱中聚合1周左右，则可变为无色透明的坚硬包埋块。修块后，在 Reicheit-Jung2040切片机上，每块骨组织用钨钢刀切出5μm的纵向不脱钙骨切片各2张，其中1张用于甲苯胺蓝染色，另1张用于荧光观察。

1.5.3 指标检测 (1)大鼠行为学指标观察:根据经典中医理论及当前证候规范化研究成果及大鼠的生物学特性，主要观测大鼠的被毛状况、活动状况及排便状况等;(2)骨组织形态计量学检测法:用Leica Qwin图像分析系统进行计量分析:(1)骨量的检测:用骨小梁体积百分比(TBV%)，即骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比进行表示，它是衡量骨量水平的主要标志;(2)骨吸收情况检测:用骨小梁吸收表面百分比(TRS%)表示，即不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它也可以判断破骨细胞的活性;(3)骨形成情况的检测:①骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比，它也可以判断成骨细胞的活性;②骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数;③类骨质平均宽度(OSW):皮质内表面有成骨细胞被覆的类骨质的平均宽度;④骨皮质矿化率(mAR):皮质内表面荧光双标记带的平均距离除以2次标记相隔的天数。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠行为学改变

正常对照组大鼠精神状态良好，反应灵活，活动敏捷，被毛光泽，饮食正常，体重日渐增加。脾虚模型组和脾肾两虚模型组大鼠均出现毛色不光、食量减少、行为迟缓、喜聚堆、弓背蜷缩、稀便等与临床脾虚证相似的症状。

2.2 脾虚、肾虚及脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TBV%的变化

表1显示，肾虚及脾肾两虚模型组大鼠胫骨TBV%显著低于假手术组，脾虚模型组的TBV%与假手术组相比无明显差异。己烯雌酚组大鼠胫骨TBV%均显著高于脾肾两虚模型组，但明显低于假手术组。与肾虚模型组相比，脾肾两虚模型组大鼠胫骨TBV%降低更为明显。

2.3 脾虚、肾虚及脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TRS%和TFS%的变化

表2显示，与假手术组相比，肾虚及脾肾两虚模型组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著增高，而脾虚模型组无明显差异。己烯雌酚组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著低于脾肾两虚模型组，相较于假手术组无明显差异。与肾虚模型组相比，脾肾两虚模型组大鼠胫骨TRS%和TFS%增高更为明显。

表1 各组大鼠胫骨TBV%的变化

表2 各组大鼠胫骨TRS%和TFS%的变化

2.4 脾虚、肾虚及脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨OSW、MAR和 mAR的变化

表3显示，肾虚及脾肾两虚模型组大鼠胫骨OSW、MAR和 mAR较之假手术组均显著增高，而脾虚模型组无明显差异。与脾肾两虚模型组相比，己烯雌酚组大鼠胫骨 OSW、MAR和 mAR均显著降低。与肾虚模型组相比，脾肾两虚模型组大鼠胫骨MAR和mAR增高更为显著。

3 讨论

骨质疏松症属中医“骨痹”或“骨痿”范畴。《灵枢·经脉》曰:“足少阴气绝则骨枯……骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却……发无泽者骨先死。”“肾为先天之本”，“肾生骨髓”，“其充在骨”。可见，骨的生长、发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力;肾精亏虚则骨髓生化乏源，骨骼失养而痿弱无力。从以上论述可以看出，肾虚是引起骨质疏松症的根本原因。长期的研究表明，中医“肾”与内分泌功能密切相关，其至少包涵了“下丘脑-垂体-性腺轴”、“下丘脑-垂体-甲状腺轴”和“下丘脑-垂体-肾上腺轴”的功能，其功能紊乱是肾虚证的一种表现［2］。诸多研究已证实［3，4］，切除卵巢可造成肾虚型骨质疏松症动物模型，因此本实验采用卵巢切除的方法建立大鼠肾虚型骨质疏松模型。结果显示，肾虚模型组大鼠代表骨量的指标TBV%显著低于假手术组，代表骨吸收情况的指标TRS%以及代表骨形成情况的指标TFS%、OSW、MAR和 mAR均显著增高，说明卵巢切除可使大鼠的骨量显著降低，使其骨形成和骨吸收均增高，造成了高转换的骨质疏松症模型。这与我们以往的研究结果相一致［5～7］。

表3 各组大鼠胫骨OSW、MAR和 mAR的变化

脾虚动物模型则选用目前公认的大黄所致的脾虚证动物模型［8，9］。理论依据为中医文献中导致脾虚的有关论述，如李杲“大忌苦寒之药损其脾胃”，李时珍对大黄“其性苦寒，能伤元气耗阴血”的论述等。大黄脾虚证动物模型是我国最早的脾虚模型之一，应用时间长，并积累了较多的实验研究资料。中医亦认为，“脾为后天之本”，脾主运化，输布精微，可充养肾精。若脾气虚弱，中阳不振，精微不布，则肾精乏源，进而使骨髓失养而致骨痿。因此，脾虚可通过导致肾虚进而引起骨质疏松症的发生。通过实验中的观察，灌胃给予大黄浓煎液14 d后，脾虚模型组和脾肾两虚模型组大鼠均表现出毛色不光、食量减少、行为迟缓、喜聚堆、弓背蜷缩、反应不灵敏等与临床脾虚证相似的症状。但骨形态计量结果显示，脾虚模型组大鼠的TBV%、TRS%、TFS%、OSW、MAR和 mAR与假手术组相比无明显差异，说明单纯的脾虚并未造成大鼠的骨质疏松症。

脾肾两虚模型的制作结合了上述肾虚和脾虚模型的造模方法，即先行卵巢切除术，术后10周开始灌胃给予200%大黄浓煎剂，4ml/只，每日1次，连续给药14 d。为巩固脾虚的状态，在随后的3个月中，仍然给予200%大黄浓煎剂4ml/只，每周2次。实验结果显示，脾肾两虚模型组大鼠TBV%与假手术组相比显著降低，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR明显增高。这一结果说明，该模型造成的是一种骨形成和骨吸收均增高，而骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松症，这与临床绝经后骨质疏松症的病理表现是一致的。另一方面也说明，虽然单纯脾虚不能造成大鼠骨质疏松症，但在卵巢切除术后再给予大黄浓煎剂，即在肾虚的基础上叠加脾虚的因素则可导致大鼠的骨质疏松，造成骨质疏松脾肾两虚模型。而脾肾两虚模型与肾虚模型组相比，大鼠的TBV%降低更为明显，且 TRS%、TFS%、MAR和 mAR增高更为明显。说明在肾虚的基础上叠加脾虚的因素，可使其骨量减少更加严重，骨转换率的增高更为显著，也就是造成了较单纯肾虚更为严重的骨质疏松症。这印证了中医“脾肾相关”理论的正确性。中医理论认为，“脾肾相关”，即脾肾两脏联系密切，它们在生理上相互资生，病理上相互影响。在生理状态下，脾主运化水谷精微，需借助肾中阳气的温煦，而肾中精气亦有赖于水谷精微的不断充实和营养;在病理过程中，肾阳不足，不能温煦脾阳，或脾虚日久，精微不能充养肾精，最终均可导致脾肾两虚。近代研究亦认为，脾虚和肾虚在人体神经、内分泌、免疫等方面相互关联。中医“脾肾相关”的理论也诠释了为何在脾虚并未造成骨质疏松的情况下，在肾虚基础上叠加脾虚的因素却加重了发病的程度。至于单纯的脾虚并未造成大鼠骨质疏松的原因，我们分析可能是因为给药时间尚短，脾虚程度不甚严重，还未引起肾虚进而造成大鼠的骨质疏松。但也说明骨质疏松症的发生，肾虚才是其根本原因，脾虚是主要因素，“脾肾相关”，两脏俱虚进而共同导致该病的发生。

综上所述，去卵巢能够造成大鼠肾虚型骨质疏松症，而单纯给予大黄浓煎剂可造成大鼠脾虚，但不能导致骨质疏松症。若将去卵巢和灌胃给予大黄2种方法合用，可造成大鼠脾肾两虚型骨质疏松症，且发病程度较单纯去卵巢明显加重。该模型有明显的脾虚证候特征，且其骨质疏松的病理过程与人类绝经后骨质疏松症相似，能反映脾肾两虚型骨质疏松患者的发病特点，具有可行性。

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