壳聚糖中药复方防治非酒精性脂肪性肝炎的实验研究

王荣琦 李建梅 南月敏 米红梅 赵素贤 孔令波 任伟光

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病病程进展的中心环节，是单纯性脂肪肝发展为肝硬化的必经之路［1］，有效阻止其发生及进展是该病治疗的关键。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，具有降血脂、提高免疫力、防癌、防治糖尿病、促进伤口愈合等多种生物功能［2］，但其在NASH中的作用及机制尚不清楚。本研究以蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine and choline deficient，MCD)饮食建立小鼠NASH模型，采用壳聚糖中药复方进行干预实验，观察其对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)表达的影响，为NASH治疗策略的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 MCD及蛋氨酸-胆碱充足饲料均购于美国ICN生物医学化学药品公司;壳脂胶囊(成分为甲壳、制何首乌、茵陈、丹参、牛漆)由内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司提供，国药准字：Z20050665。TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购于北京华美生物工程公司。总RNA提取试剂盒、RNA酶抑制剂、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶购于Promega公司。引物序列依据Gen-Bank设计，由上海生物工程公司合成。

1.2 模型建立及标本采集 清洁级7～8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠18只，体重18～20 g，购于白求恩国际和平医院动物室，随机分为3组，每组 6只。对照组以 DL-蛋氨酸(3 g/kg)和氯化胆碱(2 g/kg)充足的饲料喂养;模型组以胆碱、蛋氨酸缺乏的高脂饲料(MCD)喂养;干预组在MCD饮食基础上加用壳聚糖中药复方溶液0.7 g/kg灌胃，每日1次(壳脂胶囊常温阴凉密闭保存，临用前根据小鼠体重取所需量，将胶囊成分溶于蒸馏水2 ml中制成壳聚糖中药复方溶液)。4周末在深度麻醉下处死各组小鼠，留取血清和肝组织。部分肝组织用10%甲醛固定，备做石蜡切片;余肝组织用液氮快速冷冻，-80℃保存，备提取RNA。

1.3 血清学检测指标及方法 用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪酶法测定血清ALT、TC和TG水平;采用双抗体夹心ABC-酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清TNF-α、IL-6浓度，严格按照说明书操作。

1.4 肝组织病理学观察 甲醛固定肝组织标本，石蜡包埋，常规切片，HE染色，参照《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》［3］光学显微镜下观察肝组织脂肪变和炎症活动程度。

1.5 肝组织TNF-α、IL-6 mRNA检测 应用实时定量PCR。引物设计：TNF-α 上游 5’-GAACTGGCAGAAGAGGCACT，下游5’-AGAAGAGGCTGAGACATA GG C-3’;IL-6 上游 5’-TACCACTCCCAACAGACCTG-3’，下游 5’-TCTCATTTCCA CGATTTCCCAG-3’。采用Trizol试剂提取肝组织总RNA，以寡脱氧核苷酸和MMLV逆转录酶制备cDNA。用Taq DNA多聚酶PCR扩增cDNA产物，应用ABI PRISM 7000序列检测系统测定mRNA转录数，计算mRNA拷贝和循环数的线形关系，设定标准曲线，并依此计算实验标本mRNA的拷贝数。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，应用Student-Newman-Keuls法进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠血清ALT、TC和TG水平的变化 与对照组比较，模型组小鼠血清ALT、TC和TG水平均显著增高(P＜0.01)。干预组小鼠血清ALT、TC和TG水平较模型组明显降低(P ＜0.01)。见表1。

2.2 3组小鼠血清TNF-α、IL-6含量变化比较 造模4周后，与对照组相比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6含量均明显增高(P＜0.01)，干预组小鼠血清TNF-α、IL-6含量较模型组显著下降(P＜0.01)。见表2。

表1 3组实验小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

表1 3组实验小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

注：与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.01

组别 ALT(U/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L)34±6 1.45±0.27 0.57±0.05模型组 115±7* 4.56±0.57* 1.17±0.11*干预组 75±6# 2.96±0.28# 0.91±0.08对照组#

表2 3组小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

表2 3组小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

注：与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.01

IL-6对照组组别 TNF-α 13.6±0.9 22.6±2.5模型组 32.6±1.1* 34.3±1.2*干预组 22.8±0.9# 27.0±1.2#

2.3 3组小鼠肝组织病理变化 对照组小鼠肝组织病理学无明显异常。模型组小鼠肝组织可见大泡性脂肪变、气球样变，小叶内可见点状或灶状炎细胞浸润、坏死(箭头所示)，壳聚糖中药复方组小鼠肝组织脂肪变、炎症程度较模型组明显减轻(图1)。

图1 3组小鼠肝细胞脂肪变、炎症活动情况(HE×200)

2.4 3组小鼠肝组织TNF-α和IL-6 mRNA表达比较 与对照组相比，模型组小鼠肝组织TNF-α、IL-6mRNA表达显著增强(P＜0.01);与模型组相比，干预组小鼠肝组织 TNF-α、IL-6mRNA表达明显下降(P＜0.01)。见表3。

表3 3组小鼠肝组织TNF-α和IL-6 mRNA的表达n=6，±s

表3 3组小鼠肝组织TNF-α和IL-6 mRNA的表达n=6，±s

注：与对照组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.01

mRNA IL-6 mRNA对照组组别 TNF-α 1.13±0.13 1.13±0.12模型组 4.83±0.37* 4.02±0.52*干预组 3.28±0.39# 2.58±0.54#

3 讨论

随着饮食结构的西化和生活方式的改变，NASH的发病率日益增高［4］，美国有将近1/3成年人患有NASH，我国的发病率约占15%［5］。其发病率在肥胖、糖尿病、高血压人群中更高。大量研究显示，NASH不仅可导致严重肝病，而且与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的高发密切相关。因此，非酒精性脂肪性肝炎的有效防治对于阻止慢性肝病的进展并改善预后具有十分重要的意义。目前临床缺乏高效、无毒副作用的抗脂肪性肝炎的西药，中药复方凸显了其多组分、多途径、多靶点的治疗作用，成为目前研究的热点。

在本实验中采用MCD饮食喂养雄性C57BL/6J小鼠4周后，与对照组相比，模型组小鼠肝细胞出现大泡性脂肪变、肝小叶内可见点状或灶状炎性细胞浸润和坏死，同时血清ALT、TC和TG水平明显升高，说明MCD饮食成功诱导出了具有典型临床特征的NASH模型。血清ALT水平是代表肝损伤的灵敏指标［6］，主要存在于肝细胞的胞质中，能够反映肝细胞的完整性，其水平增高往往说明肝实质细胞受损。应用壳聚糖中药复方预处理后，肝脂肪变性、炎症反应程度明显减轻，并能一定程度上抑制转氨酶的升高，显示其对肝脏具有一定的保护作用。

肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所，各种致病因素如长期高脂饮食可通过一个或多个环节导致肝细胞内TC、TG的异常堆积。其中TG是NASH患者肝脏内蓄积的主要脂质，而TC和游离脂肪酸，特别是蓄积于线粒体内的部分，作为攻击性脂质可以促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和TNF-α的激活，进而导致肝脏损伤。因此，肝脏脂肪沉积是发生脂肪性肝炎的前提条件，轻微的重叠损伤就可诱发其产生NASH［7］。本研究中，模型组小鼠血清 TC、TG明显增加，肝组织病理出现大泡性脂肪变，说明肝脏脂质代谢发生了障碍，导致肝脏脂肪浸润及脂肪性肝炎。干预组小鼠血清TC、TG水平较模型组均明显下降，说明壳聚糖可减少肝内脂肪沉积、改善脂质代谢紊乱。其降脂的可能机制为：壳聚糖具有粘滞性，在胃中能与胃酸作用形成凝胶，从而延缓胃排空;吸附胆汁酸和胆固醇，减少肠道对胆固醇和胆汁酸的吸收;刺激肠道食物源性脂质的排泄，从而达到治疗 NASH的效果［8，9］。

近年来，细胞因子在肝脏疾病中的作用已受到密切关注。从肝细胞脂肪变性到脂肪性肝炎、肝纤维化乃至肝硬化的进展过程中，TNF-α、IL-6、瘦素、脂联素、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)等细胞因子都起了重要作用［10］。TNF-α是具有免疫效应和炎性反应双重作用的细胞因子，在肝脏主要由激活的Kupffer细胞产生。TNF-α可促进外周组织脂肪动员，使血中游离脂肪酸增加，肝细胞TG的合成及聚集增加［11］;而增加的游离脂肪酸又可使TNF-α表达增加，通过激活核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)而触发 IL-6 等细胞因子的分泌和ROS产生增多，引起脂质过氧化，导致肝细胞膜破坏和炎症反应，形成一个自我反馈的恶性循环［12］。TNF-α表达水平与体内脂质含量、肥胖程度及胰岛素抵抗程度呈正相关［13］。IL-6亦是一种具有多种生物活性的细胞因子，广泛表达于脂肪组织、肝细胞和Kupffer细胞等中。IL-6可通过促进巨噬细胞释放 TNF-α，刺激肝细胞分泌 C-反应蛋白、纤维蛋白原而发挥致病作用。有研究表明，NASH患者肝脏IL-6的表达较单纯性脂肪肝患者明显升高，且升高的IL-6可促进脂肪酸分解和游离脂肪酸的释放，直接增加肝脏TG的贮积，与TC、TG关系密切［14-16］。本研究显示，采用MCD饮食喂养小鼠4周后，模型组小鼠肝组织和血清中TNF-α与IL-6的含量较对照组明显升高，表明TNF-α和IL-6参与了脂肪性肝炎的形成与进展过程。应用壳聚糖中药复方干预后，实验小鼠无论是血清中TNF-α、IL-6的含量还是肝组织中TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平均较模型组明显下降，说明壳聚糖中药复方可降低TNF-α和IL-6的分泌，减少炎性细胞的浸润，继而发挥治疗NASH的作用。Zhou等［17］亦证实，壳聚糖可通过影响脂肪源性激素TNF-α、瘦素等的分泌来增加胰岛素的敏感性，从而缓解胰岛素抵抗，与我们的研究结果相似。

综上所述，壳聚糖中药复方可通过改善肝功能、纠正脂代谢紊乱、抑制TNF-α和IL-6的分泌、减轻炎性反应等多种途径来阻止或延缓NASH的发生发展，是防治脂肪性肝病的有效措施之一。

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