两种不同结核菌药物敏感试验方法比较

刘相 吕翠环 李玉静 杜月菊 陈海峰

近几年来，随着耐药结核菌逐渐增多，传统的结核杆菌药物敏感试验耗时长，不利于结核患者的早期有效的治疗。尽管目前有一些快速检测结核菌药物敏感性的方法，但由于仪器和试剂昂贵或者技术复杂很难推广。我们利用CLSI(NCCLS)M24-A微量肉汤稀释法原理，通过缩短药敏试验的时间，缩短整个结核菌培养及药敏试验的时间，达到快速检测患者的耐药情况，以便及时指导临床用药。本文随机选择100例患者分别采用快速实验及传统药敏试验方法进行对照。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 试验组和对照组分别随机抽取50例。试验组男38例，女12例;年龄9～84岁，平均年龄40岁。对照组男27例，女23例;年龄13～78岁，平均年龄32岁。标本来源:痰液、气管镜灌洗液、针吸物、胸水、手术标本等。

1.2 方法

1.2.1 2组采用同样的方法进行前期的处理和培养。药敏试验试验组接种在快速药敏培养基，对照组接种在传统的罗氏药敏培养基。快速药敏培养基及快速药敏试验肉汤培养基均由试剂厂家提供，改良罗-氏培养基及传统药敏用培养基均由本科室按结核病诊断细菌学检验规程自制。快速药敏实验的原理:根据CLSI(NCCLS)M24-A微量肉汤稀释法原理，将药物包括菌群分类药物事先包被在U-底板上，将结核菌研磨比浊，以培养基稀释后加入测试孔，根据各孔的情况获得MIC数据成界值范围，以此判断药物敏感性。

1.2.2 培养:研究病例均以晨痰用4%NaOH液消化15 min，PBS缓冲液平衡离心，取沉淀物分别接种于BD公司生产的液体快速结核菌培养基及改良罗氏培养基，经37℃恒温培养获得，快速培养基报阳经涂片确认，罗氏培养基经2～8周出现菌落涂片确认为分支杆菌。

1.2.3 药敏试验:凡培养阳性者均做统一抗结核药物药敏试验。试验组:常用药物及浓度:链霉素(Sm):1、2、4、8 μg/ml;异烟肼(Inh):0、2、0.4、0.8、1.6 μg/ml;利福平(Rfp):1、2、4、8 μg/ml;乙胺丁醇(Emb):2、4、8、16 μg/ml;氧氟沙星(Ofx):2、8 μg/ml;左氧氟沙星(Lfx):2、8 μg/ml;阿米卡星(Am):1、4 μg/ml;卷曲霉素(Cm):2.5、10 μg/ml;丙硫异烟胺(Pto):10、40 μg/ml;力克肺疾(Dpc):0.5、2 μg/ml;莫西沙星(Mfx):0.5、2 μg/ml，环 丙 沙 星 (Cip):1、4 μg/ml;克 拉 霉 素 (Cir):4、16 μg/ml;利福布丁(Rfb):0.75、3 μg/ml;利奈唑胺(Lz):2、8 μg/ml;氯法齐明(Cio):0.5、2 μg/ml。用于菌型鉴定药物浓度为:TCH C2—羧酸肼噻吩0.25 μg/ml，PNB对硝基苯甲酸400 μg/ml。对照组:常用药物及浓度:Sm:10、100 μg/ml;Inh:1、10 μg/ml;Rfp:50、250 μg/ml;Emb:5、50 μg/ml;对氨基水杨酸钠(Pas):1、10 μg/ml;Dpc:1、10 μg/ml;LFV:2、20 μg/ml。药物来源均由住院药房提供，与患者用药一致。用于菌型鉴定的培养基及浓度为:C2—羧酸肼噻吩(TCH)100 μg/ml)，对硝基苯甲酸(PNB)500 μg/ml。

2 结果

2.1 获得结果的时间 试验组大部分接收标本以后20～30 d可以获得药物敏感实验结果，平均26.3 d，其中小于20 d，对照组大部分在50 d以上，30 d以内未获得药物敏感实验结果。见表1。

表1 2种不同方法获得结果的时间分布 n=50，例

2.2 耐单药分布 试验组在药物的组合上比对照组多了6种，对于耐药结核菌而言尤其有意义，药物浓度也发生改变，比对照组的药物类型多，而且浓度由原来的2种，变成4种，有利于药物的选择。见表2。

表2 2种不同方法试验药物分布 n=50，种

3 讨论

经典“慢培”方法依靠鸡卵为基础的固体表面培养技术，如罗氏、Ogawa等培养基。其优点是成本低，能分离到单个菌落，通过菌落形态的观察鉴定细菌。缺点是生长缓慢，周期长，平均49.6 d，最快42 d，药敏试验需要4周时间。“快培”方法:以BD公司BACTEC MGIT960为代表的以液体培养基为基础结合仪器信号捕获的快速分离培养，获得生长数据。分离周期短，结核分枝杆菌的平均检出时间为26.3 d，最快18 d，快速药敏试验培养平均检测时间一般为7～14 d，比罗氏早2～3周。

快速药敏试验培养7～14 d出结果，传统药敏试验培养4周出结果。以BD公司 BACTEC MGIT960为液体培养基的结核菌培养缩短了培养的时间，以CLSI(NCCLS)M24-A肉汤培养基为基础的增菌培养基的结核分枝杆菌快速分离培养技术缩短了药敏试验的培养时间。BD公司BACTEC MGIT960为液体培养技术及结核分枝杆菌快速分离培养技术在实验室的应用，缩短了结核菌的培养及药敏试验的时间，使结果更快速准确，更及时的服务于临床，对患者的治疗，起到积极的作用。

通过对两种试验方法的比较，可以看出，试验组比传统对照组药敏试验时间明显缩短，对于难治性肺结核患者尤其重要，可以在短时间内指导临床及对患者的用药规范，使患者尽快恢复健康。常用药物只有2种药物浓度，而快速药敏试验对于常用药物增加了药物的浓度，常用药物增至4个药物浓度，更精确。该方法为CLSI(NCCLS)推荐的M24-A标准微量肉汤稀释法(Microbroth Dilution Method)药敏试验方法，需要的菌量少，速度快，数据全，7～14 d内提供16种药物药敏及分群鉴定数据，使合理用药成为现实。