3种流感病毒检测方法的比较和应用

张巍巍，张丽荣，胡 钰

（1．密云县疾病预防控制中心，北京101500；2．吉林大学中日联谊医院 病理科，吉林 长春130033）

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其传染性强、传播速度快，主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播［1］。对流感样病人进行快速鉴别诊断，不仅能迅速掌握疫情，而且可为临床治疗提供可靠的病原学依据。本文采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法、实时荧光定量RT－PCR法和细胞培养法3种方法检测流感病毒，比较3种方法的特异性和灵敏度，以确定其适应领域。

1 材料与方法

1．1 标本来源

2010年12月至2011年2月，密云县医院采集流感样病例398件咽拭子。流感样病例（ILI）指发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一。样本采集方法按照《甲型H1N1流感监测方案》（第1版）［2］。咽拭子标本于24h内冷藏送至本实验室，24h内未能检测的－80℃保存。

1．2 细胞培养法

吸1ml咽拭子接种到75%－90%生长成片的MDCK细胞，34℃5%CO2吸附2h，37℃5%CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变（CPE）。培养3－4d后，用1%豚鼠血球进行微量血凝试验 （HA）检测病毒的存在及滴度。将 HA＜1∶8的培养物继续细胞传代培养，HA≥1∶8的培养液用血凝抑制试验 （HI）进行流感病毒滴度和型别鉴定。

1．3 提取RNA

病毒核酸的提取方法详见QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒说明书。

1．4 普通RT－PCR

普通RT－PCR采用QIAGEN公司的One Step RT－PCR Kit。反应体系为25μl：DEPC处理H2O 11．9μl；5×buffer 5μl；引物0．5μl；10mM dNTPs 1μl；酶混合物1μl；酶抑制剂0．1μl；RNA模板5 μl。反应条件：反转录42℃10min；50℃30min；预变性95℃15min；变性94℃30sec；退火52℃30 sec；延伸72℃1min；最终延伸72℃10min。共34次循环。电泳30－40分钟后，于UVP凝胶成像系统下观察电泳条带。每次实验都以RnaseP（人上皮细胞总RNA）基因为对照，以保证标本的合格和实验的准确性。

1．5 实时荧光定量RT－PCR

荧光定量RT－PCR采用美国ABI公司提供的Taqman One step RT－PCR Kit。反应体系总体积为25μl：引物（40μM）0．5μl；探针（10μM）0．5μl；酶1．0μl；2×Master Mix 12．5μl；Rnase Free H2O 5．375μl；40× MultiScribe and RNAase Inhibitor Mix 0．625μl；RNA 模板5μl。反应条件：50℃反转录30min；95℃预热15min；95℃变性15s；55℃扩增45s；在45℃进行单点荧光检测，共45个循环。实时荧光检测有标准的S型扩增曲线，并且Ct值＜30可以判断样本为阳性。

1．6 3种检测方法灵敏度的比较

为了研究3种方法检测流感病毒的灵敏度，对流感病毒株H3型，采用MDCK细胞进行病毒校价滴定（105TCID50／ml），然后稀释成100、10、1、0．1、0．01、0．001TCID50，然后提取 H3亚型的 RNA 核酸，分别采用细胞培养、RT－PCR方法与荧光定量RT－PCR方法进行检测。比较3种检测方法的灵敏度，并同时做平行试验。

1．7 统计学处理

数据采用SPSS 13．0进行数据统计处理，比较组间阳性率差异，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2．1 3种检测方法的结果比较

普通RT－PCR共检测出阳性样本93件，荧光定量RT－PCR方法检测阳性样本129件，MDCK细胞培养病毒分离获得64株流感病毒。3种检测方法的阳性率分别为23．4%、32．4%和16．1%。经数据统计处理，三者的阳性率有明显的统计学差别（P＜0．05），荧光定量RT－PCR法的阳性率明显要高于普通RT－PCR和细胞培养法。

2．2 3种方法检测流感病毒各型及亚型结果

通过细胞培养法HAI鉴定的64株流感病毒分型及亚型结果与普通RT－PCR和实时荧光定量RT－PCR分型完全符合。从表1中可以看出2011年9月至2012年2月密云县流感病毒主要以B型和甲3亚型为主，而其中新甲型H1N1和H1亚型没有检测到。

对于阳性率较高的B型，普通RT－PCR、实时荧光RT－PCR和细胞培养3种检测方法检测的阳性率分别为20．4%、26．4%和14．6%，经计算三者阳性率具有统计学差异（P＜0．05）。同样，H3亚型的阳性率分别为3．0%、6．0%和1．5%，经计算三者阳性率也具有统计学差异（P＜0．05）。荧光定量RTPCR法检测H3亚型、B亚型的阳性率明显高于其他两种方法。各亚型阳性结果分布详见表1。

表1 各流感病毒亚型检测结果

2．3 3种检测方法的灵敏度

分别采用细胞培养、RT－PCR方法与荧光定量RT－PCR方法对不同稀释度的H3核酸样本进行检测。荧光定量RT－PCR检测结果为100、10、1、0．1、0．01TCID50的核酸样本均有标准的S型扩增曲线，并且Ct值＜30，而稀释度0．001TCID50的样本S型扩增曲线不明显，检测结果为阴性。这与胡晓武等［3］报道一致。普通RT－PCR法检测结果为0．01、0．001TCID50两稀释度在紫外下观察无条带，结果为阴性。细胞培养法0．1、0．01、0．001TCID50稀释度下无细胞CPE现象，并且HA检测结果为阴性。荧光定量RT－PCR方法随着病毒稀释度的增加Ct值增加，其灵敏度明显要高于另外两种方法。

表2 3种方法的灵敏度对比

3 讨论

RT－PCR技术作为流感病毒的重要检测方法，以其操作简单，灵敏度高，耗时短等优点，已经被广大实验室所采用［4］。普通RT－PCR鉴定流感病毒的优点是电泳条带可以凝胶回收，为后续的实验提供原料。缺点是在检测过程中容易造成污染，产物需要后期处理。因此，为保证实验结果准确性，我分子生物学实验室分4个隔开的独立工作区（即标本制备区、扩增反应混合物配制区、扩增区、扩增产物分析区），进入各个工作区必须严格遵循单一方向的顺序进行，不同区的仪器设备、物品如加样器、试剂等不能发生混淆。在实验中，以无RNA酶的水作为空白对照，只有空白对照无条带，检测样本有特异性条带才能说明试剂无污染，RT－PCR结果可信。我分子生物学实验室严格做好质量控制，避免PCR产物对环境的污染，减少假阳性结果的产生。

实时荧光定量RT－PCR是在普通RT－PCR技术的基础之上发展起来的具有高灵敏性和准确性的一项定量技术，现在已经作为流感病毒感染的主要筛查方法。通过实验结果表明，实时荧光定量RTPCR应用于甲3型流感病毒检测，灵敏度达到了0．01TCID50，在缩短检测时间的同时，大大提高检测灵敏度和特异性。而且由于整个检测过程都在封闭管中进行，能有效防止扩增产物的交叉污染，确保实验的准确。实时荧光RT－PCR检测结果不需要用紫外灯观察条带，直接通过电脑软件收集荧光信号并在电脑上显示扩增曲线，具有结果只管、重复性好、特异性和敏感性强、操作简易等优点。与普通PCR技术相比，实时荧光PCR方法已广泛应用于病原学检测的日常工作［5－9］。细胞培养法是流感病毒分离的经典方法，此法技术要求严格，操作复杂，实验周期长，对样本中病毒的含量要求高。细胞培养法分离流感病毒可以保证病毒抗原性与原始毒株相近，且可以长时间保存，对于核实疫情实验室诊断和病原学监测具有重大意义。从实验结果可以看出，细胞培养的检出率与病毒的浓度有严格的要求，当病毒浓度不大时，可能会有假阴性结果。细胞培养是培养活的病毒株，所以流感病毒标本在采集、运输、保存过程中应注意不要被灭活，因此，在优化分离技术的基础上，应加强标本质量管理。另外，MDCK细胞的代数和敏感度与流感病毒的分离有很大的关系。总之，MDCK细胞培养法是流感病毒检测实验结果准确、最常用的方法之一，是各种快速诊断方法无法替代的。

本文采用细胞培养、普通RT－PCR和实时荧光RT－PCR 3种方法对398件流感样本同时进行检测，通过结果比较验证，表明实时荧光RT－PCR对流感病毒的检出率最高，这与其他文献的检测结果一致［10］。与另外两种方法相比，无论从敏感性、特异性还是从时间上，荧光RT－PCR对于疫情的爆发更有应用价值。而细胞培养法能够分离到病毒本身，对于流感病毒监测有重要意义，有助于流感病毒病原性分析。所以在日常流感监测实验中，主要以细胞培养法为主。

另外，流感病毒的检测方法还有多重PCR、基因芯片、间接免疫荧光法、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）等［11］，在流感防控工作中，我们要灵活选择和运用这些检测技术，发挥每种技术的优点，只有这样才能提高工作效率的同时保证实验结果的准确性。

［1］Chidlow G，Harnett G，Williams S，et al．Duplex real－time RTPCR assays for the rapid detection and identification of pandemic（H1N1）2009and seasonal influenza viruses A／H1，A／H3and B．J Clin Microbiol，2010，48：862－9－866．

［2］中华人民共和国卫生部．甲型H1N1流感监测方案（第1版）［S］．http：／／www．moh．gov．cn／publicfiles／business／cmsresources／mohjbyfkzj／cmsrsdocumentMoc4308．doch．

［3］胡晓武等．一步法实时荧光RT－PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用［J］．临床输血与检验，2010，12（4）：296．

［4］石伟先，刘海林．逆转录聚合酶链反应法在北京市流感病毒型别鉴定中的应用［J］．中华预防医学杂志，2002，36（6）：382．

［5］程小雯，周 丽，赵 锦．荧光定量RT－PCR在流感病毒检测上的应用［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2004，18；289．

［6］Nalia F Habib－Bein，William H Beckwith Ⅲ，Donald Mayo，etal，Comparison of Smart Cycler Real－Time Reverse Transcription－PCR Assay in a Pulic Health Laboratory with Direct Immunofluerenscence and Cell Culture Assay in a Medical Center for Detection of Influenza A viruses［J］．Journal of clinical M icrobiology，2002，2：750．

［7］史芳芳，李红叶．不同方法检测流感病毒的敏感性［J］．国际检验医学杂志，2011，32（18）：2119．

［8］陈双峰等．实时荧光RT－PCR检测不同标本中甲型H1N1流感病毒核酸的临床意义［J］．国际检验医学杂志，2011，32（8）：861．

［9］Bergallo M，Terlizzi ME，Astegiano S，et al．Real time PCR Taq－Man assays for detection of polyomaviruses KIV and WUV in clinical samples［J］．J Virol Methods，2009，162（1－2）：69．

［10］李 婵，卢亦愚，严菊英等．实时荧光定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法与RT－PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较［J］．中国计划免疫，2005，11：360．

［11］薛文仲等．流感病毒的检测和分型技术研究进展［J］．生物技术通讯，2011，22（4）：559．